仪器分析实验指导书
适用专业： 化学工程与工艺专业
学 时： 10
福建农林大学材料工程学院 化学工程与工艺实验室 2011年8月30日
实验一 饮料中咖啡因的分析（6学时）
一、目的要求：
通过对咖啡因样品紫外吸收光谱的测定，使学生学习并掌握紫外可见分光光度计的使用方法，并能够根据测绘的吸收谱图对相关的参数进行计算。了解高效液相色谱仪的基本结构，学习高效液相色谱仪的操作技术。通过用高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因，学习和掌握液相色谱法的基本原理和外标定量分析方法。
二、实验原理：
咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约为1.2~1.8%，茶叶中约含2.0~4.7%，可乐饮料、APC药片等中均含咖啡因，其分子式为C8H10O2N4，结构式为: O C H 3 6 C H 7 3 1 C 5 NN C C H 2 8 C C N O N 4 3 9 C H 3
吸收光谱——以不同波长的光依次通过一定浓度的被测物质，并分别测定每个波长的吸光度。以波长λ为横坐标，吸光度A 为纵坐标。所得到的曲线为吸收光谱。具有不饱和结构的有机物，在紫外区有特征吸收，所以紫外光谱是有机物鉴定的一种重要辅助手段。
定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分(如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等)分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液也进入色谱系统。如流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间tR(或保留距离)和峰面积A后，可直接用tR定性，用峰面积作为定量测定的参数，采用工作曲线法(即外标法)测定饮料中的咖啡因含量。
三、实验仪器和材料：
1．仪器
紫外—可见分光光度计（自动扫描型）；带盖石英比色皿；HPLC1100型高效液相色谱仪，PDAD检测器；色谱柱：ODS(n—C18)柱；微量注射器注射器（50μL）；超声波发生器或水泵；容量瓶（5 mL，10 m，25 mL ，100mL）若干；移液管（2mL，5mL，10mL，15 mL）；漏斗；烧杯；0.45 μm混纤微孔过滤膜（或针孔过滤器）；回流冷凝装置；电炉（或电热套）；电子天平。 2．试剂
咖啡因标准品（纯度98%以上）；
待测饮料试液：可乐型饮料，茶饮料，速溶咖啡；
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流动相：30％（体积分数）甲醇(色谱纯)＋70％（体积分数）高纯水。进入色谱系统前，用超声波发生器或水泵脱气5min。
四、实验方法和歩骤：
1. 咖啡因标准试剂吸收光谱的测定
准确称取咖啡因标准品0.0010g，用配制的流动相溶解，定量转移至100mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.01mg/mL的标准咖啡因储备液。将它装入带盖的石英吸收池中，以流动相为参比，在220～360nm区域进行波长扫描，测定咖啡因的吸收光谱。 2. 反相高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因
①. 咖啡因标准系列溶液的配制
分别吸取1.0000mg/mL（按步骤1重新配制）的标准咖啡因储备液各0.00 mL、2.00 mL、5.00 mL、10.00 mL、15.00 mL至5只100 mL容量瓶中。用蒸馏水配制成咖啡因浓度分别为0，20，50，100，150μg/mL的标准系列。 ②. 样品的处理
A. 可乐型饮料
将约25mL试样置于一100mL洁净、干燥的烧杯中，剧烈搅拌30min或用超声波脱气5min，以赶尽可乐中二氧化碳。取脱气试样10.0mL，通过混纤微孔滤膜（或针孔过滤器）过滤，弃去最初的5mL，保留后5mL备用。 B. 速溶咖啡
准确称取0.60g速溶咖啡，用40mL90℃蒸馏水溶解。冷却后全部转移至50mL容量瓶中，并定容至刻度。取试样10.0mL，通过混纤微孔滤膜（或针孔过滤器）过滤，弃去最初的5mL，保留后5mL备用。 C. 茶叶
准确称取0.10g茶叶，用20mL蒸馏水煮沸10min。冷却后取上层清液。按此步骤再重复一次，将茶叶水全部转移至50mL容量瓶中，并定容至刻度。取试样10.0mL，通过混纤微孔滤膜（或针孔过滤器）过滤，弃去最初的5mL，保留后5mL备用。 ③. 色谱条件
流动相：30％（体积分数）甲醇(色谱纯)＋70％（体积分数）高纯水；流动相的流速：1.0mL/min；
柱温：40℃；ST = 9 min, PT = 2 min ;
检测波长：以紫外测试结果为准（约为273 nm）；
进样：仪器基线稳定后，进咖啡因标准样，浓度由低到高；
进样量为5μL的待测饮料试液。
④. 标准曲线的绘制
按标准试液浓度增加的顺序，在咖啡因的最大吸收波长处依次测定每个标准样的峰面积，作峰面积－咖啡因浓度的标准曲线。 ⑤. 样品测定
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