土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法

土壤酶活性及微生物测定

土壤酶活性测定 取样工具及取样方法

在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。土样在自然条件下烘干装入袋中备用。

所需试剂:

酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵[(NH4)2SO4]、甲苯、苯磷酸二钠、NaAc.3H2O、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、、

配置方法:

铵态氮标准溶液:称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中,再加水稀释至1000mL,此溶液1mL含100μg N。往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度,制备成的溶液在490nm下比色,并绘制标准曲线。 醋酸缓冲液:PH5.0,NaAc.3H2O50g,溶于适量水中,加6mol/LHAc34ml,稀释至500ml。 硼酸缓冲液:PH9.0,80毫升0.05mol/l硼砂(Na2B4O7.10H2O)和0.2mol/l的硼酸混合。 纳氏试剂:将碘化钾10g溶于10ml水中,边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱和水溶液,直至生成的红色沉淀不再溶解为止。加入氢氧化钾30g并溶解之,再加入氯化汞饱和溶液1ml,加水至200ml。静置,取上层清液,贮于棕色瓶中 酚的标准溶液:(1)原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升,溶液在暗色中稳定,(2)工作液—取50ml原液稀释至1升(1ml含0.05mg酚);分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容(分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚),待颜色稳定后,570nm比色绘制标准曲线。

测定方法

磷酸酶活性测定

一、试验原理

土壤中的磷,很大部分以有机磷化合物的形式存在。磷酸酶能促进有机磷化合物的水解。实验表明,土壤微生物对于土壤含磷有机物质的矿化起着主要作用;土壤的磷酸酶活性,在很大程度上取决于土壤的腐殖质含量,活性磷量,能矿化有机磷化合物的微生物数量,植物类型等因素,土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况。

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二、实验仪器

恒温箱、分光光度计、 三、实验药品

甲苯、苯磷酸二钠、酚、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、

四、实验步骤

取5克过20目筛的风干土样于50毫升容量瓶中,用0.8(16滴)毫升甲苯处理,15分钟后,加入5毫升苯磷酸二钠溶液(6.75克苯磷酸二钠溶于水,并稀释至1升)和5毫升相应的缓冲液(碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液,中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液,酸性磷酸酶用pH5.0的醋酸缓冲液)。仔细混合后,将反应物置于37摄氏度恒温箱中培养12小时,然后用蒸馏水定容至刻度,摇匀过滤,用5毫升水代替基质以设置对照。为了测定反应混合物中的酚量,取1毫升滤液于100毫升容量瓶中,加5毫升硼酸缓冲液(pH9.0),再加入3毫升2.5%的铁氰化钾和3毫升0.5%的4-氨基安替吡啉,摇动,溶液呈粉红色,然后再加水定容,待颜色褪到稳定时(约需20~30分钟),在分光光度计上于波长570纳米处测定溶液的光密度,根据用酚制备的标准曲线查出供试滤液中酚的含量。磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示。

脲酶活性测定

一、试验原理

土壤的脲酶活性,与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关。根基土壤可测得最大的脲酶活性,人们常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素状况。

二、实验仪器

锥形瓶、定性滤纸、震荡器、分光光度计、1mm筛、

三、实验药品

酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、铵态氮标准溶液、双蒸水

四、实验步骤

1、 准确称取10.00g过1mm筛的风干土样,置于150mL锥形瓶中,注入50mL20%的

NaCl溶液,将瓶塞紧,在振荡30min(120r/min)后,用定性滤纸过滤。 2、 取20mL滤液于50mL容量瓶中,加双蒸水稀释至40mL左右,加2mL25%酒石酸钠,

充分摇动静置5min,使其与Cd,Mg离子络合;

3、 再加入10滴1%阿拉伯胶,摇动后加2mL纳氏试剂,边加边摇,定容至刻度,5min

后用490nm比色,配制铵态氮标准溶液,绘制标准曲线,比色后求算土壤脲酶活性。 4、 结果分析

滴定法测定过氧化氢酶活性

一、试验原理

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土壤的过氧化物酶活性,与土壤的呼吸强度和土壤微生物活动相关,在一定程度上反映土壤微生物过程的强度。根际土壤的过氧化物酶活性,远较根际外土壤为高。有机质含量高的土壤,过氧化氢酶活性较强。因此,土壤过氧化物酶的活性可以表征土壤总的生物学活性和肥力状况。

本试验采用滴定法测定过氧化氢酶活性,即通过定量滴定酶促反应后剩余的过氧化氢量。 二、实验仪器

致密滤纸、酸式滴定管、1mm筛 三、实验药品

双蒸馏水、H2SO4、过氧化氢、KMnO4、

四、实验步骤

准确称取5.00g过1mm筛的风干土样,置于150mL锥形瓶中,注入40mL双蒸馏水和5mL0.3%过氧化氢,另设对照,塞紧瓶盖,振荡30min(120r/min)后,注入5mL1.5mol/LH2SO4终止反应,用致密滤纸过滤,取滤液25mL,用0.1mol/LKMnO4滴定至微红色。土壤的过氧化氢酶活性,用100g土重的0.1mol/LKMnO4毫升数表示。

土壤微生物检测

一、取样工具

无菌刮铲、土样采集器、镊子、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。

二、采土方式:

在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化,宜将样品立即进行处理或放在4℃冰箱中暂存。

三、所需培养基及配置方法

1、牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌用)

牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,琼脂15~20g,水1000ml,pH7.0~7.2,121℃灭菌20min。

2、高氏(Gause)1号培养基(培养放线菌用)

可溶性淀粉20g,KNO3 1g,NaCl 0.5g,K2HPO4 0.5g,MgSO4 .7H2O 0.5g,FeSO4 0.01g,琼脂20g,水 1000ml,pH7.2~7.4。配制时,先用少量冷水,将淀粉调成糊状,倒入煮沸的水中,在火上加热,边搅拌边加入其它成分,溶化后,补足水分至1000ml。121℃灭菌20min。 3、无氮培养基(自身固氮菌、钾细菌) 甘露醇(或葡萄糖)10g,KH2PO4 0.2g,MgSO4·7H2O 0.2g,NaCl 0.2g,CaSO4·2H2O 0.2g,CaCO3 5g,蒸馏水1000ml,pH7.0~7.2,113℃灭菌30min。 4、马丁氏(Martin)琼脂培养基(分离真菌用) 葡萄糖10g,蛋白胨5g,KH2PO4 1g,MgSO4·7H2O 0.5g,1/3000孟加拉红(rosebengal,玫瑰红水溶液)100ml,琼脂15~20g,pH自然,蒸馏水800ml,121度灭菌30min。临用

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