土壤淀粉酶产生菌的分离纯化及相关性质测定
摘要：为了了解土壤中微生物的种类和特征并从中分离出淀粉酶产生菌，对其进行纯化和培养，并测定其产生的淀粉酶的活性以及对其进行生理生化试验，了解其代谢特征，需要进行一系列的实验，并在此过程中掌握分离纯化微生物、微生物液体培养法、透明圈法测定淀粉酶活力以及生理生化试验的操作方法和原理。主要实验过程如下：从土壤中筛选淀粉酶产生菌后进行复筛，接着进行种子培养，所得发酵液用于淀粉酶活力的测定以及生理生化反应。
关键词：土壤淀粉酶产生菌 分离纯化 发酵培养 透明圈法 生理生化试验 正文：
1、土壤淀粉酶产生菌的分离与纯化 1.1 实验原理
在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。为了研究某种微生物的特性，或者大量培养和利用某一种微生物，必须事先从有关的生态环境中分离出所需的菌株，获得纯培养。获得纯培养的方法称为微生物的纯种分离法，也即是从含有多种杂居在一起的微生物材料中，通过稀释分离、划线分离、单孢子分离等方法，使它们分离成为单个个体并在固定培养基的固定地方繁殖成为单个菌落，从单个菌落中挑选所需纯种。不同微生物可用不同培养基和不同培养条件进行单菌分离获得纯种，纯种再经繁殖培养后，可用于进一步研究形态、生理等欲从含有多种微生物的样品中直接辨认出，并且取得某种所需微生物的个体进行纯培养，那是困难的。由于微生物可以形成菌落，而每个单一菌落常常是由一种个体繁殖而成。不同微生物的菌落是可以识别和加以鉴定的。因此将样品中不同微生物个体在特定的培养基上培养出不同的单一菌落，再从选定的某一所需菌落中取样，移植到新的培养基中去，就可以达到分离纯种的目的。这就是纯种分离法的原理。
在微生物的分离和纯种培养过程中，必须使用无菌操作技术。所谓无菌操作，就是在分离、接种、移植等各个操作环节中，必须保证在操作过程中杜绝外界环境中的杂菌进入培养的容器。
淀粉是有葡萄糖通过α-1,4糖苷键构成的直链淀粉和α-1,6位有分支的直链淀粉组成的。按照水解方式的不同，主要的淀粉酶可以分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶4大类。产淀粉酶的微生物有细菌、霉菌和酵母等。利用淀粉遇碘变为蓝色的特性，将分离的微生物接种在含有淀粉的固体培养基表面进行培养，利用滴加碘液后菌落周围出现透明圈，未水解的淀粉呈蓝色，
水解圈无色，判断是否产生淀粉酶及初步判断淀粉酶活力的高低。
从微生物群体中经分离、生长，在平板上形成的肉眼可见的菌落，不一定是单个细胞生长繁殖而成的，有的可能来自2个或者多个细胞。因此，纯培养的确定观察菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征等综合考虑。甚至有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。 1.2 实验器材
1.2.1 材料 土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉培养基、PDA培养基、99ml无菌水1瓶（带玻璃珠）、5支9ml无菌水/试管等。
1.2.2 用具 无菌培养基、无菌吸管、无菌水、酒精灯、无菌涂布棒（又名扩散棒、三角棒）、接种环、生物洁净工作台、生化培养箱、人工智能培养箱、手动菌落计数器（SC6）、移液器、移液枪、试管、三角瓶、显微镜等。 1.3 实验过程
1.3.1 土壤稀释液的制备
称取土壤，制备稀释度分别为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。 1.3.2 稀释平板法从土样中分离真菌
先在无菌培养皿中加入稀释度为10-7的土壤稀释液0.2mL，再加入马铃薯培养基，充分混匀铺平并凝固后倒置于28~30℃恒温培养5~6d，培养完成后观察真菌菌落形态。结果如图1所示，培养基上分布有多个菌落，根据颜色判断为有两种真菌，一种正面为青色，背面为肉色，有9个菌落，另一种正面为墨绿色，背面为黑色，有霉味，有3个菌落。
图1 稀释平板法分离真菌结果
1.3.3 平板涂抹法分离土壤中的放线菌
先在无菌培养皿中倒入适量淀粉培养基，铺成平板，凝固后，再加入稀释度为10-7的土壤稀释液0.2mL，用无菌三角玻棒在平板表面涂抹均匀，倒置于28~30℃条件下培养3~4d，观察放线菌菌落形态。结果如图2所示，并没有分离得到单菌落，而只有菌苔，颜色为黄色，有泥腥味。没有出现单菌落可能是操作出现差错，因为稀释度为10-7，并没有偏大，所以可能是操作的问题。
图2 平板涂抹法分离放线菌结果
1.3.4 平板划线法分离土壤中的细菌
先在无菌培养皿中倒入牛肉膏蛋白胨培养基，制成平板，再用分区划线法挑取稀释度为10-2的土壤稀释液一环在平板上划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于28~30℃培养。观察细菌菌落形态，结果如图3所示，有肉眼可见的单菌落，
直径约为3mm，颜色为肉色，有臭味。
图3 平板划线法分离细菌结果
1.3.5 用划线分离法对淀粉酶产生菌进行分离纯化
1.3.5.1 在分离出真菌的马铃薯培养基的平板上滴加碘液，如图4所示，可以看出仅有一个菌落的水解圈较大符合要求，挑取该菌落，在淀粉培养基上进行划线分离，倒置30℃培养。结果如图5所示。
图4 滴加碘液后的马铃薯培养基 图5 淀粉培养基上分离纯化得到的真菌
1.3.5.2 在分离出细菌的牛肉膏蛋白胨培养基上挑取单菌落，在淀粉培养基上进行划线分离，倒置30℃培养，结果如图6所示，有单菌落。
图6 淀粉培养基上分离纯化得到的细菌
1.3.5.3 将淀粉培养基上分离纯化得到的单菌落接种到斜面培养基上，培养至成熟，待用。 1.4 结果与分析
1.4.1 由图1观察可得真菌的菌落特征，本实验中分离得到的为霉菌，有两种，一种正面为青色，背面为肉色，另一种正面为墨绿色，背面为黑色，有霉味，菌落较大且疏松，菌落比较干燥，用接种环挑取菌落时较难，说明与培养基结合牢固。
1.4.2 由图2观察可得放线菌的菌落特征，本实验中没有得到单菌落，为菌苔，比较干燥，颜色为黄色，菌落较小，分布紧密，带有泥腥味。
1.4.3 由图3观察可得细菌的菌落特征，菌落小且突起，直径约为3mm，较湿，颜色为肉色，有臭味，用用接种环挑取单菌落时较容易，说明不与培养基结合。 1.4.4 由图4观察知有一个菌落的水解圈直径较大，为淀粉酶产生菌。 1.5 结论
1.5.1 对土壤中微生物进行分离筛选，观察各种微生物的菌落形态，本次实验结果如表1-1所示。
表1-1 土壤中微生物菌落特征
微生物类别 霉菌 菌 落 特 征 放线菌 细菌