大肠杆菌发酵生产dsRNA
1、引物设计：利用已获得的二化螟APN3、APN4的序列，用Primer 5.0 软件设计dsRNA引物。
2、dsRNA表达载体的构建：利用r-Taq酶，Tm值为60-50℃降落程序进行PCR，电泳，目标条带切胶回收，和绿色荧光蛋白基因片段EGFP一起连接至pGEM-T easy vector载体。然后用限制性内切酶EcoRI酶切获得粘性末端，再电泳回收。酶切反应体系如下：
Vector FD Buffer FD EcoR I Sterile deionized H2O
总体积
5 μg 10 μl 5 μl Up to 100 μl 100 μl
将pET-2P-GFP表达载体快速酶切去磷酸化，再电泳回收。快速酶切去磷酸化反应体系如下：
PET-2P-GFP表达载体 10×FastDigest Buffer FastDigest EcoR I Fast AP
Sterile deionized H2O
总体积
1 μg 2 μl 1 μl 1 μl Up to 20 μl 20 μl
37℃，5min；80℃，5min。
将线性化的pET-2P载体和具有EcoRI酶粘性末端目标基因片段连接，得到表达目标基因dsRNA的质粒，分别命名为：pET-2P-APN3、pET-2P-APN4。假设pET-2P载体和目的片段浓度相等，T4连接反应体系如下：
pET-2P载体
6 μl
目的片段
10×T4 DNA ligase Buffer T4 DNA ligase Sterile deionized H2O
总体积
4℃过夜连接。
3 μl 2 μl 1 μl Up to 20 μl 20 μl
将连接后的表达载体10 μl转入50 μl感受态DH5α，冰上放置30 min，42℃热击90 s，冰上放置2 min。在超净台中加无抗生素的LB液体培养基600 μl，200 r，1-1.5 h。吸出450 μl，留200 μl涂板(抗卡那霉素的固体培养基)。将平板盖朝上放入37 ℃恒温培养箱，0.5 h后将平板翻转放置，过夜后挑斑，摇菌菌液PCR。PCR后电泳有目的条带的菌液扩大培养后提取质粒。 3、载体表达dsRNA验证
将上述获得的所有质粒都使用标准方法转化到HT115(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，单克隆在含有100 μg/ml的卡那霉素和12.5 μg/ml四环素的LB培养基中37℃，250 rpm震荡培养14 h。将细菌发酵液按照1:100的比例接种到LB液体培养基中，当OD600=1.0时，加入IPTG至终浓度为0.1 mM，在37℃条件下继续发酵3 小时。取菌液3 ml，提取其总核酸，进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测载体是否表达dsRNA，即出现特异性条带。若结果为阳性，在10 μl总核酸提取液中加入1 μl稀释了200倍的RNase A，37 ℃温育5 min后，进一步电泳检测结果。
提取大肠杆菌的总核酸，步骤如下：
1.5 ml细菌发酵液10000 g离心5 min，弃上清，菌体用30 μl的STE buffer悬浮，再加入30 μl苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，pH8.0)，剧烈涡旋震荡100 s以上，在离心机中13000 g离心5 min，上清液即为大肠杆菌的总核酸。 4、喂食dsRNA试验方法
将已构建好的的pET-2P-APN3、pET-2P-APN4、pET-2P-GFP的大肠杆菌表达载体以1:1000的比例扩大培养在含有100 μg/ml的卡那霉素和12.5 μg/ml四环素的LB液体培养基中，于37 ℃，250 rpm条件下震荡培养至OD600=1.0，然后加入IPTG至终浓度为0.1mM，继续发酵3小时。将菌液倒入200ml离心瓶中，在7000 g下离心5min，去除上清液后，用10ml超纯水悬浮菌体沉淀。将菌液
倒入200ml离心瓶中，在7000 g下离心5min，去除上清液后，加入10ml培养基悬浮菌体沉淀。在24孔板中打入400μl体积饲料，二化螟初孵2天后挑入24孔板中。每个孔打入100μl菌液，待干后将1~2头二龄二化螟幼虫挑入孔中，每40头一个重复，每处理组三个重复。每天重复以上操作以获得新鲜的dsRNA，每天将幼虫跳入新的24孔板中，连续喂食6天。饥饿16h后，每组取6-10头虫迅速液氮冷冻后放入-80℃用于定量PCR实验，剩余每个基因三组重复，每组30头虫进行毒力测定。Cry1Ac活化毒素的LC50为0.3μg/100μl，分别选取两个剂量的Cry1Ac毒素(0.5μg/100μl，0.8μg/100μl)进行RNAi后的毒力测定。
实验技术路线：