微生物学实验指导(10.10)

实验一 显微镜的使用及细菌的革兰氏染色

一、 实验目的和内容

(一)实验目的

1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术,了解油浸系物镜的基本原理,掌握油镜的使用方法。 2. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤 (二)实验内容

1.学习油浸系物镜的使用方法。 2.制作细菌染色装片。 3.进行革兰氏染色法操作。

4.用油镜观察大肠杆菌和苏云金杆菌染色装片。

二、 实验原理

(一) 油镜的基本原理

普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。油镜是一种高倍放大的物镜,一般都刻有放大倍数,如95×、100×等。油镜头上常刻有OI(Oil,Immersion)或HI(Homogeneous immersion)字样,有的还刻有一圈红线或黑线标记,而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中,油镜的放大倍数和数值孔径(numberal aperture)最大,而工作距离最短(图3-1)。

图1-1 显微镜物镜参数图

显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离(D)的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长(λ)成正比,与物镜的数值孔径(NA)成反比.

从上式可看出,缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。 数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度(称镜口角,α)的一半正弦与介质折射率(n)的乘积。影响数值孔径大小的因数,一是镜口角,二是介质的折射率。

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当镜与装片之间的介质为空气时,由于空气(n=1.0)与玻璃(n=1.52)的折射率不同,光线会发生折射,不仅使进入物镜的光线减少,降低了视野的照明度,而且会减少镜口角。当以香柏油(n=1.515)为介质时,由于它的折射率与玻璃相近,光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射,不仅增加了视野的照明废,更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率,因而可以使物像明亮清晰。 (二)革兰氏染色

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的,是细菌学中最重要的鉴别染色法,其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。

革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性,革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低,用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小,透性降低,从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内,经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同,由于其细胞壁肽聚糖层较薄,类脂含量高,所以当脱色处理时,类脂质被乙醇(或丙酮)溶解,细胞壁透性增大,使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来,用复染剂复染后,细胞被染上复染剂的红色。

三、实验材料和用具

1. 菌种

大肠杆菌(Escherichia coli)、苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)。 2. 试剂

革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯。 3. 仪器及用具

显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。

四、操作步骤

(一) 细菌的革兰氏染色 1. 制片

(1)涂菌 用无菌操作方法从平板中沾取菌苔一环,用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而匀、直径约1 cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。

(2)干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。 (3)固定 将细菌涂片向上,通过火焰3次,以热而不烫为宜,防止菌体烧焦、变形。目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上,便于染料着色。 2. 染色

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(1)初染 于制片上滴加结晶紫染液,染1 min后,用水洗去剩余染料。 (2)媒染 滴加卢戈氏碘液,1 min后水洗。

(3)脱色 滴加95%乙醇脱色,摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30 s 至1 min),立即水洗。

(4)复染 滴加石炭酸复红液复染1 min,水洗。 (5)镜检 用滤纸吸干,油镜镜检。 (二)镜检 1. 观察前的准备

(1)将显微镜置于平稳的实验台上,镜座距实验台边沿约为4 cm。坐正。

(2)调节光源:将低倍物镜转到工作位置,把光圈完全打开,聚光器升至与载物台相距约1mm左右。观察染色装片时,光线宜强;观察未染色装片时,光线不宜太强。 2. 低倍镜观察染色装片

首先上升镜筒,将细菌染色装片置于载物台上,用标本夹夹住,将观察位置移至物镜正下方,物镜降至装片0.5 cm处,适当缩小光圈,然后两眼从目镜观察,转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物像时,改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片,把合适的观察部分移至视野中心。 3. 高倍镜观察

眼睛离开目镜从侧面观察,旋转转换器,将高倍镜转至正下方,注意避免镜头与玻片相撞。再用目镜观察,仔细调节光圈,使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部分移至视野中心,绘图。不要移动装片位置,准备用油镜观察。 4. 油镜观察

(1)提起镜筒约2cm,将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油。 (2)从侧面注视,小心慢慢降下镜筒,使油镜浸在油中至油圈不扩大为止,镜头几乎与装片接触,但不可压及装片,以免压碎玻片,损坏镜头。

(3)将光线调亮,左眼从目镜观察,用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转),直至视野中有物像出现时,再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快未找到物像.必须再从侧面观察,将油镜降下,重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。

(4)再次观察,提起镜筒,换上另一块细菌染色装片,依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察。绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。 5. 镜捡完毕后的工作

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