实验一 显微镜的使用及细菌的革兰氏染色
一、 实验目的和内容
（一）实验目的
1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。 2. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤 （二）实验内容
1．学习油浸系物镜的使用方法。 2．制作细菌染色装片。 3．进行革兰氏染色法操作。
4．用油镜观察大肠杆菌和苏云金杆菌染色装片。
二、 实验原理
（一） 油镜的基本原理
普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。油镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。油镜头上常刻有OI（Oil，Immersion）或HI（Homogeneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numberal aperture）最大，而工作距离最短（图3-1）。
图1-1 显微镜物镜参数图
显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比.
从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。 数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。
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当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n＝1.0）与玻璃（n＝1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n＝1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明废，更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。 （二）革兰氏染色
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
三、实验材料和用具
1. 菌种
大肠杆菌(Escherichia coli)、苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)。 2. 试剂
革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等）、香柏油、二甲苯。 3. 仪器及用具
显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。
四、操作步骤
(一) 细菌的革兰氏染色 1. 制片
（1）涂菌 用无菌操作方法从平板中沾取菌苔一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而匀、直径约1 cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。
（2）干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥（温度不宜过高）。 （3）固定 将细菌涂片向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色。 2. 染色
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（1）初染 于制片上滴加结晶紫染液，染1 min后，用水洗去剩余染料。 （2）媒染 滴加卢戈氏碘液，1 min后水洗。
（3）脱色 滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30 s 至1 min)，立即水洗。
（4）复染 滴加石炭酸复红液复染1 min，水洗。 （5）镜检 用滤纸吸干，油镜镜检。 （二）镜检 1. 观察前的准备
（1）将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4 cm。坐正。
（2）调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。观察染色装片时，光线宜强；观察未染色装片时，光线不宜太强。 2. 低倍镜观察染色装片
首先上升镜筒，将细菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至装片0.5 cm处，适当缩小光圈，然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升（或使镜台下降）至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合适的观察部分移至视野中心。 3. 高倍镜观察
眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相撞。再用目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部分移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观察。 4. 油镜观察
（1）提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位（镜头的正下方）滴一滴香柏油。 （2）从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。
（3）将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转)，直至视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快未找到物像．必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。
（4）再次观察，提起镜筒，换上另一块细菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察。绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。 5. 镜捡完毕后的工作
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