细胞生物学实验2014-2015（1）
报告成绩 实时记录成绩 实验五 牛蛙骨髓染色体标本的制备与观察
学生姓名 学号 班级
座位号： 同组同学 日期： 年 月 日
备注：
【Introduction】
（1）简述染色体显色技术：将没有染色的中期染色体经过预处理后，再用不同的方法和染料处理，使染色体上出现明暗相间或深浅不同的明显而稳定的斑带。每条染色体都可被准确识别和鉴定，甚至染色体结构异常也可被检出。染色体显色技术分为两大类，一类是产生的染色带分布在整个染色体上，如G、Q和R带；另一类是只能使少数特定的区域显带，如C、T和N带。染色体显色技术极大地促进了细胞遗传学的发展，使每条染色体都可被准确识别和鉴定，甚至出现小的染色体结构异常也可被检出。 （2）制备中期染色体标本的原理和应用：识别染色体的形态特征的最佳时期是细胞有丝分裂中期和早后期。这时染色体收缩程度最大，形态最稳定，并且分散排列、易于计数。如果在同一时间内获得不同物种的染色体标本，就可以了解不同物种之间的染色体水平的异同；或者在同一时间内获得同一物种不同技术处理条件下的染色体标本，还可以了解不同技术处理对染色体的影响。
【Materials & methods】
实验仪器：复式双筒显微镜（带油镜）；Motic数码互动系统；擦镜纸/盖玻片；载玻片/镊子；记号笔；小片滤纸；移液器/吸头；香柏油/二甲苯；搪瓷盘，剪刀，烧杯，小离心管，玻璃注射器；离心机，一次性手套，骨剪（实验班公用），冰箱（0℃）。
实验材料：肉用成体牛蛙（两组1只）。
实验试剂：0.65％生理盐水；甲醇—冰醋酸(3:1)固定液；蒸馏水；自来水;Giemsa染液。 实验操作：
1．动物前期处理：牛蛙称重→注射秋水仙素→3.5~4小时后麻醉→取牛蛙→肢解。
2．取骨髓：剪下四肢→剔骨→剪开骨髓腔→生理盐水冲洗→分四个离心管离心→弃去上清液→生理盐水吹打沉淀物→合并于一管。
3．低渗：每管加蒸馏水1 ml→吹打混匀→30度下静置20 min。
4．固定：离心→弃去上清液→加甲醇-冰醋酸固定液l ml→固定15分钟→吹打悬浮→重复上面步骤一次→离心→弃去上清液→吹打悬浮。（一共固定2次）
5．滴片：从冰箱取出载玻片→立即从高处滴20 μl悬液→待干燥。 6．染色：放入Giemsa液中染色20分钟→自来水缸中浸去浮色→待干燥。
7．镜检：首先10倍镜下找到线团状细胞核→转到40倍镜下拍照保存→如果效果不好可转回10
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倍镜再次寻找→转到40倍镜下拍照保存→找到满意的图像后将图像移至视野正中央，转油镜观察图像，拍照保存。（观察完毕立即清理油镜镜头）
【Results】
如下图所示，在100倍油镜下，可以观察到许多染成深色的细胞核，以及少数的线团状细胞核。所得标本中细胞密度较适中。处于分裂中期相的细胞数量较少，约占10%左右。分裂中期的每条染色体呈现X型，有两条染色单体，四条染色体臂，长度适中，呈蓝紫色，中间由着丝粒相连接。牛蛙的染色体数目2n=26。我观察到的分裂中期的染色体略有重叠，分的不是特别开。
【Discussion】
1. 讨论实验为何出现所得结果。若实验结果不理想，请分析是何原因？如何改进？
答：（1）染色体分散不好，有重叠：因为是在30度下低渗的，所以温度应该足够，有可能是低渗时间不足；也可能是载玻片取出后放置了一会儿，冰冻不足或有油污；滴片高度有70厘米应该足够，所以还可能是没有吹气使其散开。
（2）染色体边缘发毛，结构不清晰：可能是固定时间不够，或者细胞与固定液没有充分混匀；还可能是低渗过度；或者油镜镜头不干净，所以每次观察完毕应该立即清理油镜。
2. 讨论中期染色体染色在医学遗传学中的实际应用。
答：在同一时间内获得不同个体的染色体标本，就可以了解不同个体之间的染色体水平的异同；或者在同一时间内获得同一物种不同技术处理条件下的染色体标本，就可以了解不同技术处理对染色体的影响。
举例来说，染色体复杂重排是一种罕见的染色体结构异常，通常涉及3个及3个以上的断裂点。某个具有多种先天性异常的新生儿，经诊断为1号和5号染色体的非平衡易位。用高分辨G显带染色体技术对患者父母的染色体进行检查，发现患者的母亲有一个复杂重排，再对父亲做类似检查便可确定该患者的核型 [1]。
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【Questions】
1. 取骨髓前，为什么要给牛蛙注射秋水仙素？
答：秋水仙素的作用是抑制纺锤体的形成，对细胞微管系统有影响，可以使分裂的细胞停止在有丝分裂中期，这样可以得到比较多的有丝分裂中期细胞。有丝分裂中期的细胞染色体已经复制，在显微镜下能观察得比较清楚。要注意的是秋水仙素也具有致癌的作用，要尽量避免直接接触。
2. 低渗处理对实验有何作用？
答：低渗处理是凭借反渗透作用原理，使细胞充分吸水膨胀，让染色体分散开来；同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
3. 骨髓细胞染色体制备实验中为什么滴片需要用预冷酒精浸泡的载玻片?
答：预冷酒精浸泡的载玻片既是低温处理过的，又可以借酒精的挥发提供低温环境，造成温差，有利于高处滴片。如果载玻片冷却不够，会影响染色体的附着和铺展。
4. 试分析植物材料和动物材料在制备染色体标本过程中的区别。 答： 如下表所示。 标本类型 步骤 植物材料 （常规压片）秋水仙素→固定→解离→冲洗→醋酸洋红染色→压片 （去壁低渗法）秋水仙素→酶解去壁→低渗→离心→固定→吉姆萨染色→高处滴片→干燥 动物材料 注射秋水仙素→低渗→离心→固定→吉姆萨染色→高处滴片→干燥 解离：根尖、茎尖等体细胞需经盐酸处理,除去细胞间的果胶层,并使细胞壁软化,才便于压片。 酶解去壁：用纤维素酶和果胶酶等混合酶液除去植物细胞壁。[2]
【References】
1 黄浩杰，张锡然，陈宜峰，等.应用G显带染色体荧光原位杂交(FISH)技术研究复杂的染色体易位.遗
传学报，1996，23(5)∶388-392.
2 去壁低渗法制备植物染色体标本实验:
http://wenku.http://www.35331.cn//link?url=cUedFoatwYW1_ofZ8Vqy7UBGReHRja5XFVdIJlUr0z6h9i8GxxAqbT10jtxoBRNrcYAI9enVUOZcIDCeDyC5f2lA6B-dYdFQANdk2xEyq07