猪圆环病毒2型辽宁株全基因组克隆与序列分析
隋昀原，荣柳，陈美君，朱耀才，沈国顺
【摘 要】摘要：本试验从辽宁地区某猪场疑似患有断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的猪群中采集病料，采用PCR方法进行猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV2）的检测，在此基础上对阳性病料进行PCV2全基因组克隆和序列分析。结果表明，PCV2辽宁分离株基因组全长为1768bp，与国内外PCV2分离株的同源性为95.9%～99.5%，其中与丹麦分离株（EF565365）、澳大利亚分离株（AY424405）和江苏分离株（FJ158606）同源性最高，均为99.5%；与广东分离株（JX912915）同源性最低，为95.9%。 【期刊名称】中国畜牧兽医 【年(卷),期】2013(040)011 【总页数】4
【关键词】猪圆环病毒2型；全基因；克隆；序列分析
猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）是一种单股环状、无嚢膜的DNA病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属，是目前已发现的能进行独立复制的最小的动物病毒之一（殷震等，1997）。据其致病性、抗原性及核苷酸序列的差异，PCV可分为2个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1全长1759bp，对猪无致病性。PCV2基因组全长为1767／1768bp，具有致病性，是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原（Harms等，2001）。此外，研究发现PCV2还与猪皮炎和肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）及幼龄仔猪的先天性震颤（CT）等多种疾病有关（Harms等2002；Wellenberg等，2004；Novosel等，2009；Morandi等，2010）。这些疾
病给养猪业带来严重的经济损失，已引起世界各国的广泛关注。本研究以PCV2辽宁分离株为材料，克隆了PCV2全基因组，并与国内外一些PCV2分离株全基因组进行了比对和序列分析，为进一步进行辽宁地区猪圆环病毒病的流行病学调查及防制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 猪肺脏组织病料采自辽宁地区某猪场疑似患有PMWS的病死猪；pMD18-T载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞、GoTaq?Green Master Mix、DL2000DNA Marker、限制性内切酶 HindⅢ和BamHⅠ、DNA回收试剂盒等均购自TaKaRa公司。
PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、冰箱、超净工作台、台式高速离心机。 1.2 引物设计与合成 根据国内外已发表的PCV2全基因组序列，利用DNAStar软件设计1对引物，用于扩增PCV2全基因组。引物序列为：上游引物：5′-GCGAATTCAACCTTAACCTTTCTTATTC-3′
；
下
游
引
物
：
5′-
ATGAATTCTGGCCCTGCTCCC-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 病毒DNA的提取和PCR扩增 取少许肺脏组织病料，加入适量的PBS充分研磨，使其成为匀浆，将研磨液置于-20℃冰箱中反复冻融3次，4000r／min离心15min，取上清，采用 AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit提取DNA，并采用沈阳农业大学预防兽医学实验室保存的PCV2检测引物对病料进行PCR检测。
将检测结果为PCV2阳性病料按上述步骤提取DNA后进行PCR扩增。PCR反应体系40μL：上、下游引物各4μL，模板 10μL，灭菌水 2μL，
GoTaq?Green Master Mix 20μL。PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，60.3℃退火30s，72 ℃ 延 伸2.5min，30 个 循 环；72 ℃ 延伸10min。取5μL扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统观察结果。
1.4 PCR产物的克隆与序列分析 用DNA回收试剂盒回收PCR扩增产物，纯化后连接pMD18-T载体，转化DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养。筛选白色菌落接种于5mL含有Amp的LB液体培养基中，于37℃、120r／min振荡培养。参照质粒小量提取试剂盒说明书提取过夜培养菌的重组质粒，用HindⅢ和BamHⅠ对其进行双酶切鉴定。取阳性重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。采用DNAStar软件对PCV2全基因组序列与国内外9个PCV2分离株全基因组序列（表1）进行核苷酸同源性比对并绘制系统进化树。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增 用扩增PCV2全基因组的引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳和成像系统观察可见1条约1768bp的条带（图1），与预期片段大小相符。 2.2 PCR产物的酶切鉴定 将PCR产物与pMD18-T连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选白色的阳性重组子，用HindⅢ和BamHⅠ进行双酶切鉴定，结果显示有1768和2650bp的2条特异性条带（图2），与预期片段大小相符。
2.3 序列测定结果与分析 含有PCV2全基因组双酶切鉴定阳性的重组质粒测序结果见图3。由图3可知，PCV2辽宁分离株基因组全长为1768bp。运用DNAStar软件将该目的片段与国内外其他一些PCV2分离株全基因组序列进行核苷酸同源性比对和遗传进化树分析。同源性比对结果表明PCV2辽宁株与国