酵母菌的染色和观察
【摘要】此次实验采用美蓝染液水浸片法和子囊孢子染色法观察酵母菌的各项
形态特征。通过对染色后的酵母菌细胞进行观察，可以观察到死、活细胞的对比，正在进行出芽生殖的酵母细胞，以及孢子囊中的子囊孢子。
【关键词】酵母菌 美蓝染液水浸片法 子囊孢子染色法 出芽生殖
【前言】此次实验的目的，是通过用美蓝染色制成水浸片和水-碘水浸片的实验方法，来
观察酵母的生活形态和出芽生殖的生殖方式，并了解酵母菌对人类生产生活的重要意义。 美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色，酵母细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。
酵母菌是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子(子囊孢子和担孢子)的能力，可将酵母分成三类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过出芽生殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”（类酵母）。目前已知大部分酵母被分类到子囊菌门。酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物。可在缺氧环境中生存。酵母菌在自然界分布广泛，主要生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，而在酿酒中，它也十分重要。
100ml水配制成液体培养基。平分为两份分
1.材料
1.1菌种
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 1.2溶液和试剂
美蓝染液，碘液，孔雀绿水溶液，番红水溶液。
1.3仪器和其他用品
载玻片，盖玻片，酒精灯，接种环，镊子，显微镜等。
2.方法
2.1配置麦氏培养基和液体培养基 2.1.1称量和溶化
2.1.1.1麦氏培养基的配置：按照配方称取0.2g葡萄糖，0.36gKCl,0.5g酵母浸膏，1.64g醋酸钠和3g琼脂溶于水中，加热溶化，冷
却后加水至200ml。PH自然状态。
2.1.1.2液体培养基的配置：按照配方称取取0.5g酵母膏、1g蛋白胨、2g葡萄糖加入
装在两个锥形瓶中。 2.1.2高温灭菌
121℃条件下灭菌30min。 2.2.美蓝染液水浸片法 2.2.1制片
先在载玻片中央滴加一滴0.1％吕氏碱性美蓝染液，再滴加少量水稀释。无菌操作取试管中培养的酵母菌少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。 2.2.2镜检
将制好的水浸片放置3分钟后镜检。先用低倍镜，再用高倍镜，观察酵母菌的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。
2.3.子囊孢子染色法 2.3.1制片
先在洁净的载玻片中央滴一小滴无菌水，再无菌操作从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜。 2.3.2干燥、热固定
待涂片晾干后在酒精灯火焰上略微烤干。 2.3.3染色
加孔雀绿水溶液于涂片处染色5min。 2.3.4水洗
用水轻轻地冲洗，直至流出的水无色。 2.3.5复染
用0.5%番红液染色1min。
2.3.6水洗、干燥
用水轻轻地冲洗，直至流出的水无色为止，然后将涂片晾干。 2.3.7镜检 先用低倍镜，然后换高倍镜观察染色后的酵母菌。
3结果及分析
3.1实验结果如下图：
图1美蓝染色后的酵母菌细胞（10×100） 图2子囊孢子染色后的酵母菌细胞（10×100）
3.2结果分析
图1中美蓝染色结果可推断，无色细胞为活酵母菌细胞，蓝色细胞为已死的酵母菌细胞，浅蓝色细胞为衰老的酵母菌细胞。从图中还可以观察到正在进行出芽生殖的酵母菌细胞。
图2中结果显示，用子囊孢子染色法染色后，菌体呈红色，子囊孢子呈绿色，图中可以看到每个孢子囊内2个或3个孢子，实际上由所学知识可知每个孢子囊内有4个子囊孢子。
3.2思考题
1.根据你的观察结果，吕氏碱性美蓝染液的作用时间与酿酒酵母的死活细胞比例变化是否有关系？
答：有。随着作用时间的延长，死细胞在总细胞数中的比例增大。
2.酿酒酵母除了通过出芽方式进行无性繁殖外，还可以形成子囊孢子进行有性繁殖，你在实验中是否观察到酿酒酵母的子囊孢子？
答：通过子囊孢子染色法染色，观察到了酿酒酵母的子囊孢子。在显微镜下可以看到每个孢子囊内2个或3个孢子，实际上由所学知识可知每个孢子囊内有4个子囊孢子。
4．小结
此次实验操作较简单，实验成功的关键在于滴加染液要适中，以防用盖玻片覆盖时，过
多染液会溢出，过少会产生大量气泡。盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。染色的时间长短也要适中，要使染后的颜色不能太深也不能太淡，否则将不利于观察。通过对染色后的制片仔细观察，可以清晰的观察到死、活细胞的对比，以及正在进行出芽生殖的酵母细胞。子囊孢子染色后能观察到其中的子囊孢子。实验现象较明显易观察，实验中染色较成功。
参考文献：
【1】沈萍 陈向东.微生物实验[M].4版.高等教育出版社，2007.70-81页