第四章 生物化学与分子生物学技术 第2节 分子生物学技术
1．DNA片段的PCR扩增 (1)准备器材
(2)在0.2 mL PCR薄壁离心管中加入5_μL10倍浓缩的PCR缓冲液，4种脱氧核苷酸的溶液各5 μL,1_μL模板DNA，5_μL引物1和5_μL引物2,29_μL双蒸水。
(3)煮沸5_min之后冰浴2 min，低速离心，按照1单位/μL加入Taq聚合酶。 (4)扩增DNA片断的反应程序：将离心管放入PCR仪中，盖上样品池盖。在94_℃的条件下预热5 min，再设置反应程序为：94 ℃，30 s―→55 ℃，30 s―→72 ℃，1 min(以上过程循环30次)。最后一次延伸条件为72_℃，1_min。运行反应程序。
2．DNA分子的测定
[合作探讨]
探讨1：如何避免在PCR操作中被外源DNA污染？
提示：在PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液和蒸馏水都要在使用前进行高压灭菌。
探讨2：为什么要将微量离心管放在离心机上进行离心？ 提示：离心的目的是使反应液集中在离心管底部。
探讨3：PCR需要耐高温的TaqDNA聚合酶、引物等条件，如何通过设置对照实验进行验证？
提示：在对照组中不加入TaqDNA聚合酶或引物，与实验组形成对照，就可以证明PCR需要耐高温的TaqDNA聚合酶和引物。
[思维升华]
1．PCR实验操作的注意事项
(1)PCR所用的缓冲液配制一定要严格，或者直接购买专用扩增缓冲液。
(2)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、吸液枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。
(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。 (4)PCR实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等，均有可能导致DNA片段扩增的失败。
(5) PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物是PCR成功的关键。
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