微生物实验教学
来源：http://www.jyu.edu.cn/huaxue/kejian/weishengwuxue/syjx.htm
实验一 培养基的制备 一、实验教学目标基本与要求 1、明确培养基的配制原理。
2、掌握配制培养基的一般方法和步骤。 二、实验内容
1、介绍培养基的配制原理和方法步骤 2、动手称量试剂、配制牛肉蛋白胨培养基 三、培养基的制备过程
称量--配置--调节pH值--过滤--分装--灭菌 1.称量
按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状（如肉膏），应用烧杯称量。 2.配调
向上述烧杯中加入所需要的水量（可视情况不同，一次或多次加入水），搅拌，使其溶解（可加热助溶）。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。
如果配方中含有淀粉，则需先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品，待完全熔化后补足所失水分。 3.调节pH值
一般做法是：培养基溶解均匀并冷却至室温时用pH试纸测pH，然后根据要求加酸或碱（一般用1molHcl和1molNaOH），要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然pH时，不用调节。 4.过滤
用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。 5.分装
将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热装。 分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。分装量可分为下面几方面：
（1）斜面：装量为管长的1/4-1/5。
（2）液体培养基、高层培养基、半固体培养基：装载量不超过管长的1/3。 （3）三角瓶：装量不超过容积1/2。 6.灭菌
塞棉塞，包扎，灭菌。
高压蒸汽灭菌法：是在密闭的加压容器内进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于密闭，增加了器内的压力，使水的沸点升高，从而获得高于100度的蒸汽温度。 四、实验报告
记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。 五、问题和思考
l．配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么? 2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查? 3．试设计实验对饮料进行无菌检查。
实验二 消毒与灭菌
一、实验教学目标与基本要求
了解消毒和灭菌的原理，掌握各种灭菌方法的操作步骤。 二、器材和试剂
培养皿、试管、吸管、电烘箱、牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿(6套一包)，手提式高压蒸气灭菌锅、培养基牛肉膏蛋白胨平板、紫外线灯等。溶液或试剂3%~5%石炭酸或2%~3%来苏尔溶液等。 三、实验内容： 1．干热灭菌法 2． 高压蒸汽灭菌 3．紫外线灭菌法 四、实验步骤 （一）干热灭菌法 1、基本原理
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。 2、操作步骤 （1）装入待灭菌物品
将包好的待灭菌物品（培养皿、试管，吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。
（2）升温
接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。当温度升至100℃时，关闭排气孔。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温，此时如果还未达到所需的160—170℃温度，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需温度。 （3）恒温
当温度升达到160～170℃时，恒温调节器会自动控制调节温度，保持此温度2h。干热火菌过程。严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。 （4）降温
切断电源、自然降温。 （5）开箱取物
待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。电烘箱内温度末降到70℃，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。 3、思考题：
（l）在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么?
（2）为什么干热火菌比湿热灭菌所需要的温度要高，时间要长?请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较实验方案。
（二）、高压蒸气灭菌 1、基本原理
高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表2-1），二是湿热的穿透力比干热大（表2-2），三是湿热的蒸气有潜热存在。1g 水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。一般培养基用0.1Mpa（相当于15 Ib/in2 或1.05kg/cm2），121.5℃,15～30min 2、操作步骤
（1）首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。切勿忘记加水，同时水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。
（2）放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
（3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
（4）用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121.5℃，20min 灭菌。灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。
（5）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。
（6）将取出的灭菌培养基，需摆斜面的则摆成斜面，然后放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。 3、实验报告 （l）结果
检查培养基灭菌是否彻底。 4、思考题
(1) 高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽?灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？
（2）在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素? （3）灭菌在微生物实验操作中有何重要意义?
（4）黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的孢子对热的抗性哪个最强?为什么?
（三）紫外线灭菌 1、基本原理
紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200~300nm 的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm 的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA 链的交联，从而抑制了DNA 的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2 氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2）。O3 和H2O2 均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室，接种箱，手术室内的
空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2m 为宜。此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯以前；可在无菌室内(或接种箱内)喷洒3%～5%石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可用2%～3%的来苏尔擦洗，然后再开紫外灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。 2、操作步骤 （l）单用紫外线照射
a 在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射30min，将开关关闭。 b 将牛肉膏蛋白胨平板盖打开15min，然后盖上皿盖。置37℃培养24h。共做三套。 c 检查每个平板上生长的菌落数。如果不超过4 个，说明灭菌效果良好，否则，需延长照射时间或同时加强其他措施。 （2）化学消毒剂与紫外线照射结合使用
a 在无菌室内，先喷洒3%～5%的石炭酸溶液，再用紫外线灯照射15imn。 b 无菌室内的桌面，凳子用2%～3%来苏尔擦洗，再打开紫外线灯照射15min。 c 检查灭菌效果:方法同“单用紫外线照射”。
因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光下工作。 3、实验报告 （1）结果
记录两种灭菌效果于下表中 :处理方法 平板菌落数 1 2 3 灭菌效果比较 紫外线照射 3%-5% 石炭酸 + 紫外线照射 2%-3% 来苏尔 + 紫外线照射
4、思考题：
（1）细菌营养体细胞和细菌芽孢对紫外线和的抵抗力会一样吗，为什么？ （2）你知道紫外线灯管是用什么玻璃制作的？为什么不用普通灯用玻璃？ （3）在紫外灯下观察实验结果时，为什么要隔一块普通玻璃？
（四）微孔滤膜过滤除菌 1、基本原理
过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成，出口处可连接针头，人口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。