A: 样品中不含靶蛋白或者含量太低，可增加蛋白上样量，设置已知标准量蛋白的对照；抗体稀释比例太低，孵育时间不够；转膜不好，转膜后可先用丽春红染色观看染色效果；曝光时间过短，增加曝光时间；抗体保存不当，效价降低。
Q: 目的条带位置偏低或者偏高？
A: 胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶，小分子蛋白要用高浓度胶。
Q: 有非特异性条带？
A: 目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带；一抗特异性不好，换用特异性较好的单克隆抗体；二抗非特异性引起的结果，麒盟生物，www.chembio-engine.com可设立一组不加一抗只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异性结合；样品蛋白质可能降解，提取蛋白时注意冰上操作，加入适当的蛋白酶抑制剂，避免样品反复冻融；抗体浓度过高，降低一抗和二抗的浓度。
Q: 胶片是一片空白，是怎么回事？
A: 如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；ECM底物中H2O2，不稳定，失活；ECL底物没覆盖到相应位置；二抗失活。
Q: 目的条带是白色，周围有背景？
A: 目的蛋白含量太高；一抗浓度偏高，二抗上HRP催化活力太强。