实验七、人类外周血染色体标本制备、G带观察及核型分析 姓 名： 学 号： 班 级： 同组同学： 带教教师 实验日期： 一、实验原理（Principle） 在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上，此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。 在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。在细胞培养过程中加入植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA) ，可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。再通过离心、低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 有许多显示Ｇ带的方法，最常用的是将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行处理，然后用Giemsa染色。胰酶可以从染色体上抽取蛋白特定的组成部分。通过胰酶处理使G带区的疏水蛋白被除去或使它们构型变为更疏水状态。由此可见在G带区中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。关于显带机理有多种论点，总的来说，还不能完全解释显带的机理问题。 二、操作步骤（Operational procedure） （1）人类外周血染色体标本制备 1、采血 2、培养:RPMI1640培养液，37℃? 0.5℃恒温中培养72小时。 3、秋水仙素(colchicine)处理:在终止培养前2-3小时，加入秋水仙素。 4、离心:以1000转/分离心10分钟，弃上清，留沉淀并用吸管打匀。 5、低渗处理:加8毫升预温(37℃)的0.075M KCl低渗液（hypotonic solution），用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，37℃水浴箱静止25－30分钟。 6、预固定:低渗后，加新配的固定剂（甲醇：冰醋酸， 3:1 ）１毫升，打匀。 7、离心:以1000 rpm离心10分钟，弃上清。 8、固定:加入5ml新配置的固定液，悬浮细胞，室温固定10-15分钟。 9、离心:1000rpm离心10分钟，弃上清。 10、再固定：加入5ml固定液（甲醇：冰醋酸=1：3），室温固定10-15分钟。 11、再离心:1000转/分离心10分钟，弃去上清液。 12、再固定:加入固定液（甲醇：冰醋酸1：1）打匀，固定10－15分钟。 13、制片:固定后，1000转/分离心留下0.2ml沉淀物，吸取细胞悬液滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在酒精灯焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥。 - 1 - （2）人类染色体Ｇ带标本制备及观察 1、先将胰酶液水浴加热到37℃。 2、将染色体标本浸入胰酶液中，作用时间分别为15s、30s、45s。(标本需预先经60-70℃烤2小时，或37℃恒温老化3-7天) 3、取出玻片标本，在生理盐水中过一下，再经过蒸馏水洗。 4、Giemsa 染色8分钟。 现象：在原来存在着浅痕迹的玻片上出现淡紫色的痕迹。 5、自来水洗、晾干。 6、镜检：在低倍镜下选择分散及显带良好的分裂相，然后在油镜下观察。选取有好的、代表性的染色体拍照。 三、实验结果（Results） 实验结果如右图所示。 经观察的，该人类外周血染色体标本共有46条（23对）染色体。且有一条X染色体和一条Y染色体。即该血液标本为男性的血液。 根据该图还可知，此时该细胞正处于有丝分裂的中期（也有可能为有丝分裂后期）。 本图为在胰酶处理15s后得到的标本。 人类外周血染色体标本图 四、讨论（Discussion） - 2 -