行琼脂糖凝胶电泳，纯化扩增片段，可以直接测序或克隆到合适的载体再测序。
22． 你在做Southern印迹分析，并且刚完成了凝胶电泳这一步。根据方案，下面一步骤 是用NaOH溶液浸泡凝胶，使DNA变性为单链。为了节省时间，你略过了这一步， 直接将DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上。然后用标记探针杂交，最后发现放射自
显影片是空白。错在哪里?
如果你的杂交探针是双链的，可能因为在加人杂交混合物之前忘记将探针变性而得到空白的放射自显影结果。
23．切口移位(nick translation)标记探针的主要步骤有哪些? (1)DNaseI造成切口；
(2)DNA聚合酶III的5’ ?3’外切核酸酶进行切割； (3)DNA聚合酶Ⅲ的5’?3’合成酶进行修补；
(4)在修补过程中，随着切口(nick)的移动，将放射性的底物掺人到双链DNA中。 24．用EcoRI和Hind Ⅲ分别切割同一来源的染色体DNA，并进行克隆，在前者的克隆
中筛选到A基因，但在后者的克隆中未筛选到A基因，请说明原因。 原因是：HindⅢ的切点在A基因内。
25．什么是Western印迹?它与Southern印迹有什么不同?
Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。
26．用一限制性内切核酸酶切割Lac+ Tet+的质粒载体，已知该酶识别的是4个碱基序列， 并产生有两个碱基突出的单链末端，该酶在lac基因内有切割位点，并在第二个氨基
酸密码子内，该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用
DNA聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后重新连接成环，转化Lac- Tets 受体菌，筛选Tetr转化子，问：Lac的基因型是什么?并说明原因。
基因型是lac-．原因是在该密码子中插入了两个碱基，造成了移码突变，所以Lac的基因是缺陷的。
27．在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA
而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加上细菌的启动子?
这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子之故。
四、问答题：
1． 说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。
2． 什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 受哪些因素影向?
3． 影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些?
4． 什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?
5．细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途?
6．λ外切核酸酶(1ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用?
7．Mn2+、Mg2+对Dnase I(deoxyribonuclease ?)的活性有什
么影响?Dnase I在基因工程中有什么作用? 8．质粒如何维持在细胞中的稳定？
9．由于基因工程是人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操作基因的安全，进行
严格的监控，质粒载体的安全性是十分重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几 个方面?
10．为什么野生型的?噬菌体DNA不宜作为基因工程载体? 11． 什么是蓝白斑筛选法?
12． 蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性? 13． M13系列载体具有哪些优缺点? 14．黏粒载体具有哪些特点与不足?
15．辅助噬菌体DNA和相应的噬菌粒是如何协同工作的? 16． 如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法 克隆该基因?
17． 什么是基因文库?
18． 什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗
传学上的基因库有什么不同?
19． 什么是cDNA文库(complementDNAlibrary)?同基因组文库有何差别?
20． 黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出 这些不足之处。
21．什么是同聚物加尾连接法(homopolymer tails joining)?用何种方法加尾?具有哪些优 缺点?
22．何谓接头连接法(1inker ligation)?
23．什么是同裂酶?为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高?
24．为了大量获得许多用于生化鉴定的产物，你想将拟南芥中的一个序列已知、编码单
体酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达，你如何确保最终能得到产物?
25．某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因内有一Bgl I的切点。现用
Bgl I切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培
养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片 段的重组体?
26． 以pBR322 DNA作为载体，从四环素抗性基因区克隆外源DNA时，可采用环丝氨
酸富集法筛选重组体，说明其基本原理和基本操作过程。
27． 放射性抗体检测法(radioactive antibody test)的基本原理是什么?
28． 什么是随机引物(random primer)?如何标记DNA? 29．什么是印迹(blotting)杂交?
30．什么是原位菌落杂交(colony hybridization)? 31．说明Southern杂交的原理和方法。
32．Northern印迹与Southern印迹有什么不同?
33．建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆?
答案： 1． 答：
限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则，即属名+种名+株名的各一个首字母，再加上
序号。 基本原则： 3-4个字母组成，方式是：属名+种名+株名+序号； 首字母： 取属名的第一个字母，且斜体大写；第二字母： 取种名的第一个字母，斜体小写； 第三字母： (1)取种名的第二个字母，斜体小写；
(2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。
第四字母： 若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定， 但用正体。 顺序号： 若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、
Ⅱ、Ⅲ、… 等，用正体。 2． 答：
Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限 制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松 动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因 条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星 活性。
概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5％, v／v)；(2)限制性 内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA)；(3)低离子强度(<25 mmol／L)；(4)高pH(8．0 以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如
Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。 3． 答：
影响DNA连接酶催化连接反应的因素有很多，但温度对连接反应的影响较大。黏性末
端链通常以12°C一15°C最好，这种温度有利于末端退火和连接酶的活性稳定。温度高了难以进行末端退火，低于上述温度会降低连接酶的活性。平末端连接以室温为宜，因为平末端连接不存在DNA的退火问题，但是温度高于30℃，连接酶特别不够稳定。平末端连接时连接酶的浓度要比黏性末端连接时高10-100倍。DNA中有残存的tRNA不会抑制DNA连接酶的活性，但是，如果NaCl的浓度高于150mmol／L，则对连接反应有强的抑制作用。
另外反应体系中有NH4+离子的存在，对E．coli DNA连接酶具有激活作用。E．coli DNA 连接酶需要NAD+作辅助因子，而T4 DNA连接酶需要ATP。 4． 答：
Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到两个片段，其
中大片段的分子量为75kDa，它具有5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性，小片段具有5'-3'外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中会降解5'引物的5'-3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。 Klenow酶主要有下列用途： (1)修复反应，制备平末端
可用Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5'或3'突出末端，制备平末端，
这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA片段通过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备3'末端标记的探针。
用Klenow酶修复5'突出末端的反应主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填
补反应；而修复3'突出末端则是用Klenow酶的3'-5'外切核酸酶的活性，是切割反应。用Klenow酶的切割反应来修复3'突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的选择。
(2) 标记DNA3'突出末端(protruding end)
该反应分两步进行：先用3'-5'的外切核酸酶活性除去3'突出末端，产生3'隐含末端，然
后在高浓度的标记底物( -32p-dNTP)存在下，使降解(3'-5')作用与聚合(5'-3')作用达到平衡。这种反应也叫交换或取代反应(exchange／replacement reaction)。不过这一反应用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的3'-5'外切核酸酶活性较强。
(3)其他的一些用途：包括用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析、用于cDNA第二链
的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primer extension)制备单链DNA探针等。 5．答：
主要差别是：CIP68°C时失活，而BAP68°C稳定，且耐酚抽提。应用：
(1)dsDNA的5'端脱磷酸，防止DNA的自身连接。但是用CIP处理后，最好将CIP除去
后，再进行连接反应。
(2)DNA和RNA脱磷酸，然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。 6．答：
外切核酸酶是从 噬菌体感染的E．coli中分离纯化的，能够从双链DNA上依次切下5'
单核苷酸，作用底物是双链DNA的5'磷酸末端，不能切割羟基化5'端。该酶虽然能切割单链DNA,但效率较低(下降200倍)。不能切割带切口或缺口的dsDNA。该酶作用时是行进性的，一步一步进行的。在基因工程中主要用于除去双链DNA突出的5'末端，以便让末端转移酶加尾。 7．答：
DNase I是一种内切核酸酶，在Mg2+存在下，DNase I随机切割DNA两条链中的任意一
条链；当Mn2+代替Mg2+时，DNase I几乎是在双链DNA两条链相对的位置上打开缺口，使双链DNA断裂，产生的末端几乎是平末端或只突出1～2个核苷酸的DNA片段。 DNase I有许多用途：(1)在切口移位标记中，制造切口；(2)在足迹法中保护DNA； (3)除去RNA制备物中的DNA；(4)体外转录中除去DNA模板；(5)检测染色体中的转录
活性区；(6)产生可在噬菌体M13载体上进行测序的随机克隆。 8．答：
质粒通过以下几种机制维持在细胞中的稳定： (1)多聚体质粒的分解
如果质粒在复制时形成多聚体的话，在细胞分裂过程中质粒丢失的可能性就会增加。一个多聚体是由多个单体相互连接而成的。多聚体的形成可能是由于在复制终止时发生错误或者是由于单体间重组的结果。由于多聚体在细胞分裂时将作为一个质粒进入一个子细胞，这样，多聚体的形成就大大降低了质粒的有效拷贝数，因此，多聚体也就大大增加了细胞分裂时质粒丢失的机会。为了避免这种情况的发生，很多质粒都具有位点专一性重组的系统，可以破坏多聚体。 (2)分离(partitioning)
质粒通过一种分离系统来防止在细胞分裂过程中质粒的丢失，这种机制保证在细胞分裂过程中每个子细胞至少可得到一个质粒拷贝，这是由称为par功能(Par functions)完成的。 所谓par功能是指某些质粒，包括F、R1等质粒上具有的一些短的区域，这些区域能够增强质粒拷贝的合适分配。如果从质粒中将这种区域拿掉，质粒丢失的频率就会相当高。已经深入研究过P1质粒的分离系统，发现P1质粒的分离系统由一个顺式激活par序列和两个蛋白ParA和，ParB的基因构成，其中一个蛋白同par位点结合。
关于par位点是怎样增强质粒适当分离的机制有两种模型，按照这两种模型，细菌的膜具有真核生物有丝分裂纺锤体的功能，在细胞分裂之前将质粒分开。par位点是质粒同质膜结合的区域，在细胞分裂时，由于膜的生长，质粒的两个拷贝就被拉到两个子细胞中。这两个模型对于细胞分裂时，质粒同质膜的结合是怎样保证每个细胞至少得到一个质粒的解释是不同的。
模型．A：par位点同细菌质膜的一个假定位点结合。在这个模型中，每一种质粒都有它自己独特的同质膜结合的位点。当细胞生长时，位点也加倍，每一个质粒拷贝结合一个位点。由于这些位点随着细胞分裂而分开，每一个质粒拷贝将分配到一个子细胞。这就保证了质粒不会丢失。该模型要解决的问题是质膜上必须有许多独特的位点以供不同的质粒拷贝结合，这似乎不太可能。
将模型A稍微改动一下，就可以满足质粒分离所需的位点。如果我们假定质粒结合的位点不在质膜而是在细菌的染色体上就可以了。染色体上有很多的位点，并且随着DNA的复制而加倍，这些位点可供质粒结合。剩下的唯一问题就是在质膜上有同染色体结合的独特位点，这样，质粒将随着染色体的分离而分离。
模型B同模型A基本类似，在这个模型中，质粒的两个拷贝在同质膜结合之前必须通过它们的par位点相互配对。然后这两个质粒在细胞分裂过程中随着质膜位点的分离而分离。高拷贝数的质粒常常具有增加质粒适当分离的位点，但是这些区域并没有相同的结构，并不以相同的机制起作用。例如，质粒pSCl01的par区可以增加质粒的超螺旋，至于超螺旋的增加如何帮助质粒的适当分离是不清楚的。可能是增强了质粒分离后的迅速复制，防止了下次分裂时的丢失。 (3)质粒溺爱(plasmid addiction)
即使质粒具有分离功能，质粒也会从增殖的细胞中丢失。在一类复仇的细胞中，质粒能够编码一些杀死丢失了质粒的细胞。像F质粒、R1质粒、以及P1噬菌体都有这种功能。这些质粒编码一些毒性蛋白质，这些蛋白质一旦表达就会杀死细胞。根据质粒的来源不同，毒性蛋白质可通过各种方式杀死细胞。
例如，质粒的毒性蛋白Ccd,通过改变DNA螺旋酶来杀死细胞，由于螺旋酶的改编，引起了双螺旋DNA的断裂。质粒R1的杀手蛋白Hok,破坏细菌细胞质膜的功能，引起细胞活力的丧失。为什么毒性蛋白仅仅是在细胞丢失了质粒之后立即杀死细胞?当细胞含有这种质粒时，沉溺系统的蛋白质或RNA可作为一种解毒药，既能阻止毒蛋白的合成，又能同毒蛋白结合并阻止毒蛋白起作用。
然而，这些其他基因的产物要比毒性蛋白不稳定得多，所以它们会很快失活。如果一个细胞丢失了质粒，既没有毒性蛋白也没有解毒剂的合成。但是，由于解毒剂更不稳定，当解毒剂失活后，毒性蛋白就可以起杀伤作用。这些系统使细胞对质粒产生溺爱，并防止细胞丢失质粒。