(3)你朋友的图解方法有效吗?
3．打算将一个cDNA克隆到一个表达载体，以便在E．coli中大量制备相应的蛋白质。
这个cDNA的两侧具有BamHI的位点，因此计划将它
从BamH[的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行：载体用BamHI切割以后，立即用碱性磷酸酶处理除去5’磷酸；接着将处理过的载体同用BamHI切割的cDNA片段混合，加入DNA连接酶后进行温育，连接之后，将DNA同已处理过的可以接受DNA的细菌感受态细胞混合。最后，将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因，所以，转化的细菌能够存活。 实验中同时设置了4个对照：
对照1： 将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上；
对照2： 将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上； 对照3： 将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有cDNA片段)的
载体转化过的细菌细胞涂布在培养乎板上； 对照4： 将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用DNA连接酶连接(但没有cDNA片
段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养子板上。
在进行第一次实验时，感受态细胞不是自己制备的，结
果，在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落(表22．2)。在第二次实验中，自己制备感受态细胞，但这一次，所有的平板上都没有菌落生长(表22．2)。接着又进行了第三次实验，这次得到了转化子(表22．2)。从实验平板上挑出12个菌落，分离了质粒DNA，并用BamHI进行切割，其中9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带，另三个克隆中切出一个cDNA片段，实验终于获得成功。
(1)你如何看待第一次的实验结果?对照1的目的是什么? (2)影响第二次实验结果的原因是什么?对照2的作用何在?
(3)对照3和4各有什么作用?
(4)为什么要用碱性磷酸酶处理载体? 表22．2 cDNA克隆的结果
—————————————————————————
制备的样品 实验结果
1 2 3
————————————————————————— 对照1 只有细胞 TMTC 0 0 对照2 未切的载体 TMTC 0 >1000 对照3 省去磷酸酶处理，无cDNA TMTC 0 435 对照4 无cDNA TMTC 0 25 实验样品 TMTC 0 34
————————————————————————— 注：TMTC=too many to count，多到无法计数。 4. 打算在细菌中表达一种稀有的人类某种蛋白质，以便能够大量制备这种蛋白。为确
保分离纯化，决定将一段6个组氨酸的短肽加到该蛋白
质的N端或C端。这些带有组氨酸标签的蛋白质能够紧紧地同Ni2+柱结合，但很容易被EDTA或咪唑溶液洗脱。此法可以一步完成大量蛋白质的纯化。
图22．9是编码该蛋白的核苷酸序列。请设计一对PCR
引物，各含有18个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列，另外，在N端有一个起始密码，其后是6个组氨酸密码子。另外设计一对引物，能够在C端加上6个组氨酸和一个终止密码。
L R D P Q G
G V I
5’-CTTAGAGACCCGCAGGGCGGCGTCATC-3’ N末端
M A T R
R A A
5’-GGT CGT ATG GCT ACT CGT CGC GCT GCT CTT GCT GCA AGT CTC TCT TAG AAG TGT-3’
L A A S L S *
C末端
答案 1．答：
要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达，通常遇到的问题有：
(1)细菌的RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子。 (2)大多数真核基因有内含子，这些内含子在转录后从前
体mRNA中被切除而形成成熟mRNA。细菌细胞没有这样的机制来去除内含子。
(3)有些真核生物的蛋白质是通过前体分于加工而来的，
例如胰岛素就是通过加工去除 前体分子内部的33个氨基酸残基而来，剩下的两段肽链分别形成胰岛素的?、?链。
(4)产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解。
针对上述可能出现的问题，建议在克隆的过程中采取以下措施：
①应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始
密码子ATG的细菌强启动子的附近(含有这种序列的载体称表达载体)。
②可以以激素的mRNA为模板用反转录酶合成激素的基
因。这种DNA不含内含子可插入到载体中进行克隆。此外，如果蛋白质序列短则可通过化学合成得到该基因。合成的基因应含起始密码ATG、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列，以及1—2个终止密码：
ATG——————编码序列——————TGA TAG
现在，这个合成基因可被插入载体中。
③有时加工过程可以在离体条件下进行。如果加工有困
难，可以用合成基因，从而免除加工过程。
④选用合适的突变型宿主从而防止蛋白酶水解。如果用
酵母作为宿主上述许多问题都可以较容易地解决，尤其是现在有既能在大肠杆菌中又能在酵母中复制的穿梭质粒载体。 说明：
1)ATG,TAG和TGA是对应mRNA中的转录起始信号AUG和终止信号UAG,UGA的DNA序列。
2)克隆生长素释放抑制因子基因时采用化学合成基因的
方法。生长索释放抑制因子是一种由下丘脑分泌的激素，长14个氨基酸残基，因此人工合成的基因，包括在宿主菌中表达所需的转录的起始和终止信号，仅51bp长。
2． 答：(1)KpnI-BamHI的接头及它的寡聚核苷酸片段示于
图A22．4-A。这种接头片段可 以用于两种连接，即BamHI末端和KpnI末端连接。
(2)用DNA连接酶处理混合物得到图A22．4-B所示的重
组DNA分子。如图中箭头所指，BamH I-Kpn I接头中三个缺口有两个可被连接起来。这就足以将KpnI切割的片段连接到BamHI切割的载体中去。
(3)你朋友的方案无论是在理论上还是在实验上都很好。
当DNA被转化到细胞之后，剩下的一个缺口能够被修复。应该注意到，可以用多核苷酸激酶和ATP将寡聚核苷酸的5’端加上一个磷酸，经这种处理寡聚核苷酸上的所有缺口都可以用连接酶进行封口。 （A）
BamHI Kpn I 5’-GGTACGATCC-3’ 3’-C
C-5’
3’CATGCTAG5’ 寡居拼接片段
GGATCGTACC GGTACGTACC CCTAGCATGG CCTAGCATGG
图A22.4 BamH I-Kpn I的接头 (A)KpnI-BamHI接头所需要的寡聚核苷酸片段，它的序列同
第一个寡聚核苷酸的序列相同。
(B)BamHI-KpnI接头片段介导KpnI切割的片段连接到BamHI切割的载体中。箭头表示可以连接的缺口。打开的环表示只有经酶促修复后才能连接的缺口。划线部分是两种寡聚核苷酸的序列
3. (1)如果仅是细胞本身就能产生菌落，意味着发生了某种错误，这有几种可能性。首先是错误地选用了带有克隆载体并具有抗生素抗性的细胞制备感受态；或是感受态细胞已经污染上了具有抗生素抗性的细胞。最后一种可能性是忘记了在平板中添加抗生素，或是抗生素的量加得不够。
因此，对照1就是要确认感受态细胞和培养平板没有问题 （2）如果用为切割的载体转化细胞得不到菌落，也是由于某种错误所致。这也有几种可能性。其中是感受态细胞制备的不合适，以而不能摄取DNA；其二是平板中抗生素太多；其三可能是平板制备的不正确，不能支持细菌的生长。 因此，对照2如同对照1一样，确认细胞和平板都能像预期的那样，能够很好地工作。
（3）对照3是检查切割载体的末端是否同预期的一样，以及连接酶是否具有活性。限制性内切酶的制备物（或是所用的缓冲液）偶尔也会污染上外切核酸酶，这就会修饰末端，使得不能连接。或者是缓冲液的成分不合适，这也会妨碍连接酶的作用。
对照4是检查碱性磷酸酶是否有活性。
（4）用碱性磷酸酶处理载体，以除去5’磷酸可防止载体自我连接。载体重新连接可以产生很高的带有载体而没有插入物的菌落本地。因为cDNA没有用磷酸酶处理，它保留5’磷酸，仍然能同载体连接。因此采用磷酸酶处理载体以降低