产淀粉酶菌种的分离、筛选、鉴定和产酶条件优化
一．设计背景
淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，是用于酿酒、食品、医药、纺织、饲料等具有商业价值的重要酶类。是最早实现工业化生产，迄今为止用途最广，产量最大的酶制剂品种。所以开始产淀粉酶菌种的分离、筛选、鉴定和产酶条件优化。
二．目的要求
分离筛选出产淀粉酶菌种，并进行鉴定和产酶条件的优化
三．实验技术步骤及详细流程
采集含菌样品 设计配制选择性培养基 分装灭菌 平板涂布分离纯化菌种（透明圈法） 划线分离进一步纯化产酶菌种（透明圈法） 液体培养法复筛产酶菌种，检测产酶性能 目的菌种斜面和甘油保藏 目的菌种的染色法显微观察 目的菌种的常规生理生化鉴定 考察紫外线对产酶菌种生长及产酶性能的诱变效应 考察碳源或氮源种类及浓度对产酶菌种生长及产酶性能的影响 考察PH对产酶菌种生长及产酶性能的影响
1.采集含菌样品
根据所选产酶菌种的要求，我们宜在淀粉制品霉变的样品中分离。故在新校区的花坛中提前一周埋入淀粉制品（距离地表5cm左右），一周后用小铁勺在新校区的花坛中挖出泥土，放入提前准备好的塑料袋中。
2.培养基的配制
2.1 平板筛选培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%,可溶性淀粉2．0％，琼脂1．5～2．0％，pH自然。121℃灭菌20min。
2.2 摇瓶复筛培养基：玉米粉3％，玉米浆3％，CaCl20．13％， Na2HP04 0．3％，(NH4)2S04 0．4％，pH 6．0。121℃灭菌20min。
2.3 斜面保存培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0～20.0g，加蒸馏水至1000ml。pH7.0～7.2。
2.4 种子培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0～20.0g，加蒸馏水至1000ml。pH7.0～7.2。
2.5 产酶液体培养基：玉米粉3％，玉米浆3％，CaCl20．13％， Na2HP04 0．3％，(NH4)2S04 0．4％，pH 6．0。121℃灭菌20min。
3.分装灭菌
将所需要灭菌的仪器，如培养皿，锥形瓶，试管，移液管灭菌，使用加压蒸汽灭菌法。一般使温度升高到121摄氏度，高温加压20Mmin。
4.平板涂布分离纯化菌种（透明圈法）
称取土壤样品1g溶于9mL无菌水中，将水样品5mL溶于 45mL无菌水中，分别用无菌水梯度稀释至1×107倍，取1×105、1×106、1×107稀释液涂布于平板筛选培养基表面。
37摄氏度培养72h，用无菌的牙签挑选单菌落影印2-3皿，同时用签字笔对各单菌落标号。影印过的培养皿37℃培养72h，取其中一皿喷洒稀碘液记录有水解圈的单菌落。根据记录从剩余2皿中挑取对应有透明圈的单菌落，转接，经平板划线法得到纯种。接种斜面保存培养基中，培养后于4℃保藏。
5.划线分离进一步纯化产酶菌种（透明圈法）
将初筛得到的菌种涂布于平板筛选培养基表面。依然37摄氏度培养72h，用无菌的牙签挑选单菌落影印2-3皿，同时用签字笔对各单菌落标号。影印过的培养皿37℃培养72h，取其中一皿喷洒稀碘液记录有水解圈的单菌落。挑取有透明圈的单菌落，转接，经平板划线法得到纯种。通过复筛，划线分离进一步纯化产酶菌种，接种斜面保存培养基中，培养后，于4℃冰箱保藏。
6.液体培养法复筛产酶菌种，检测产酶性能
6.1 复筛得到的纯菌种接种于30／250mL种子培养基，37摄氏度、250r／min 摇床培养过夜。种子液以2％接种量接种于产酶液体培养基 50／500mL，相同条件培养72h，发酵液8 000r／min离心10min，取上清液测酶活，每个样品重复3次，最后结果取平均值。
6.2 酶活测定方法
测定方法：3，5一二硝基水杨酸比色法。 1.标准梯度糖液配制， 分别取0.5mg/ml的葡萄糖标准液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于1~6号试管中，并用蒸馏水补足到1ml。 2.还原糖液的提取 ，精确称取样品1.0g于100ml小烧杯中，再加入50ml蒸馏水搅匀，用水定容到100ml。 3.过滤，取滤液1ml于7、8号试管中，待用。 4.称取样品1.0g，放入100ml小烧杯中。加入10ml 6mol/L的HCl，和15ml蒸馏水，沸水浴加热25min. 用胶头滴管滴2~3滴碘化钾—碘溶液于培养皿中（可以稍微稀释），用细玻璃棒 蘸少量样品与之进行反应，若无深蓝色物质产生说明总糖已经水解完全，否则继续沸水浴加热并每隔5min以相同的方法再次测定，直至完全水解。5.取出完全水解的样品，冷却后滴加2~3滴酚酞，用6mol/L NaOH滴定至中性。 6.用水定容到100ml，过滤，取5ml滤液，再次定容到100ml。 7.取6中第二次定容的液体1ml于9、10号试管中，待用。
1.OD540的测量及标准曲线的制作, 在10支试管中加入0.5ml DNS试剂，混匀，十只试管放入500ml装有少量水的烧杯中，进行沸水浴加热5min，再流水冷却。2、每支试管加入再4.0ml蒸馏水并摇匀。 3、取液体装入比色皿中，每个样品测三次，取其平均值为其OD540，以未加葡萄糖的试管即1号试管内的液体作为参比液。 4、取1~6号试管中的数据，做出OD540~还原糖含量曲线，纵坐标为OD540，横坐 标为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，单位mg。 5、在曲线上读出7~10号试管的含量值。
1.计算.取7，8号试管含量的平均值作为还原糖含量值，取9，10号试管含量的平均值作为总糖的含量值。2.还原糖含量%=还原糖毫克数×样品稀释倍数（100） 样品毫克数（1000 ） ×100% 总糖含量%= 水解后还原糖毫克数×样品稀释倍数（2000）×0.9 样品毫克数（1000 ） ×100%
酶活力定义：在40摄氏度、pH 6．0，1min从可溶性淀粉中释放 出lumol还原糖所需的酶量。
7.目的菌种
将筛选出的菌种接种到我们的斜面培养基或者用甘油保存。 斜面保存培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0～20.0g，加蒸馏水至1000ml。pH7.0～7.2。
菌种甘油保存方法： 1. 将要保存菌种接种于LB液体培养至对数生长期（肉眼见培养体系内浑浊即可）， 2 .将甘油稀释至浓度为50%（等体积蒸馏水加等体积甘油，甘油需要慢慢吸）， 3 .将甘油、2 ml离心管、枪头等试验用品于121℃灭菌20min , 4 .无菌条件下将菌液与50%浓度甘油1:1等体积混合于离心管中，甘油终浓度为25%, 5 .于-20℃冰箱内保存。
8.目的菌种的染色法显微观察
（1）取目的菌种进行涂片、干燥、固定。涂片不宜过厚。 （2）初染，滴加结晶紫以刚覆盖为宜，染色1~2min，水洗。 （3）媒染，用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
（4）脱色，用滤纸吸去残水，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色，立即水洗。脱色时间一般约20~30s。
（5）复染，用0.5%番红溶液复染约2min，水洗。革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。
（6）镜检，用油镜观察。
9.目的菌种的常规生理生化鉴定 9.1糖发酵实验
（1）取四支倒置了徳汉氏小管的试管，向其中分别加入无菌乳糖培养基、无菌葡萄糖培养基、无菌蔗糖培养基、无菌麦芽糖培养基。 （2）用记号笔在各试管外壁上分别做标记，以区分各培养基，并在培养基中加入指示剂（溴甲酚紫）。
（3）在四支试管中接种目的菌种，将接种后的试管放置于37℃的温箱中培养24h—48h。 （4）观察各试管中颜色变化以及徳汉氏小管中有无气泡。 9.2甲基红试验（MR试验）
（1）菌种接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃培养48-72h。
（2）配置甲基红试剂（甲基红0.02g，95%酒精60mL，蒸馏水40mL），20mg甲基红溶于60 mL95%乙醇中，然后加入40mL蒸馏水。
（3）取出后加甲基红试剂3-5滴，立即观察结果。如果培养液呈红色者为阳性，橙色者为可疑，黄色者为阴性。 9.3接触酶试验
取洁净载玻片1张，用接种环挑取细菌，加3%H2O21滴，立即观察结果。 9.4硫化氢产生试验
（1）取SIM培养基（胰胨 20g、多价胨 6g、硫酸铁铵 2g、硫代硫酸钠 0.2g、琼脂 3.5g）30g,加热溶解1000ml蒸馏水中,分装试管，121℃高压灭菌15分钟备用。
（2）将目的菌种穿刺接种至培养基中。将所有试管置于37℃下培养24-48小时。
（3）检视所有SIM培养基，观察接种线有无黑色产生，将记录结果，判断目的菌是否具有产生硫化氢之能力。再观察微生物是否沿接种线向四周扩散，并判断其是否具运动性。