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实验 酶促反应动力学
————蔗糖酶米氏常数的测
【目的要求】
1．了解酶促动力学研究的范围。
2．以蔗糖酶为例，掌握测定米氏常数(Km)
【实验原理】
在酶促反应中，当反应体系的温度、pH和酶浓度恒定时，反应初速度(v)则随底物 浓度[S]的增加而加速，最后达到极限，称为最大反应速度(v)。Michaelis和Menten 根据反应速度与底物浓度的这种关系，推导出如下方程：
v?V[S]
km?[S]此式称为米氏方程，式中Km称为米氏常数，按此方程，可用作图法求出Km。方法有： 1．以v[S]作图
由米氏方程可知，v=V／2时，Km＝[S]即米氏常数值等于反应速度达到最大反应速度一半时所需底物浓度。因此，可测定一系列不同底物浓度的反应速度v,以v对[S]作图。当v＝V／2时，其相应底物浓度即为Km。 2．以1／v对1／[S]作图
取米氏方程的倒数式：
1km11??? vV[S]V
以1／v对1／[S]作图可得一直线，其斜率为Km／V，截距为1/V。若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于—l／Km。
本实验以蔗糖为底物．利用一定量蔗糖酶水解不同浓度蔗糖所形成的产物(葡萄糖和果糖)的量来计算蔗糖酶的Km值。葡萄糖和果糖能与3，5—二硝基水杨酸试剂反应，生成桔红色化合物，可于520nm处比色测定之。
【试验材料】 1．试剂
(1)标准葡萄糖溶液：准确称取100mg葡萄糖溶于少量饱和的苯甲酸溶液(0.3%)，再转移到
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100ml容量瓶中，用饱和苯甲酸溶液稀释到刻度，混匀，即得浓度为1mg／m1的标准葡萄糖溶液。冰箱贮藏可长期保存；
(2)pH4.5的0.1mol/L醋酸缓冲液：取lmol/L醋酸钠溶液43m1及lmol／L醋酸溶液57m1，稀释至1000m1即得；
(3)pH4.5的10％蔗糖溶液：准确取l0g蔗糖溶于少量pH4.5的0.1mol／L醋酸缓冲液，转移到100ml容量瓶中，用同样缓冲液稀释到刻度备用；
(4)3，5—二硝基水杨酸试剂：溶液I：4.5％NaOH溶液300m1，1％3，5一二硝基水杨酸溶液880m1及酒石酸钾钠(KNaC4O6·4H20)255g三者一起混合均匀。
溶液Ⅱ：取结晶酚10g及lo％NaOH溶液22m1，加蒸馏水稀释成100ml，混匀。 溶液Ⅲ：取6.9gNaHSO3溶于64ml溶液n中。
将溶液皿和溶液I混合，激烈振摇混匀，即得3，5—二硝基水杨酸溶液，放置一周后备用。 (5)酵母蔗糖酶溶液：称取鲜酵母l0g于研钵中，加少量细砂及10一15ml蒸馏水研磨。磨细后置冰箱中，过滤，滤液加2—3倍体积冷丙酮，搅拌均匀后离心，沉淀用丙酮洗两次，真空干燥得固体粉末状酶，再溶于100ml蒸馏水，即得酶溶液。若有不溶物可用离心法除去。 该酶液活力以6—12单位为佳。蔗糖酶活力单位的定义为：在一定条件下反应5min，每产生lmg葡萄糖所需要的酶量。备用。 2．器材
(1)100m1三角烧瓶2只； (2)研钵1只；
(3)50m1及100m1容量瓶各1只； (4)离心机1台(4000rpm)； (5)糖管8支； (6)恒温水浴1台；
(7)吸量管：1.0ml×2支； (8)秒表1只；
(9)72l型分光光度计1台。
【实验方法】 1．标准曲线的绘制
取干净糖管6支，如下表所示添加试剂。 管号 试剂 0 1 2 0.4 1.6 3.0 3 0.6 1.4 3.0 4 0.8 1.2 3.0 5 1.0 1.0 3.0 标准葡萄糖溶液, ml 0 0.2 蒸馏水 ， ml 2.0 1.8 3，5二硝基水杨酸液， ml 3.0 3.0 加毕混匀．于沸水中准确煮5min，取出用自来水冷却3min，稀释至25ml，混匀后以零号管调零点，于520nm处测定吸光度。以葡萄糖含量为横坐标，以吸光度为纵坐标作图。 2．根据活力选择酶浓度
将10％蔗糖溶液稀释成pH4.5的6.5％的溶液，取此溶液5m1于试管中，共加两管。 将两管同时置于25℃水浴中保温5min，然后向管中加入蔗糖酶溶液1.0ml，立即混匀， 同时用秒表计时，准确反应5min后，立即加入5ml0.1mol/LNaOH溶液终止酶反应。另 一管先加入5.0ml0.11mol/LNaOH溶液，再加入蔗糖酶溶液1.0ml(此为对照管)。
取干净糖管3支，第l、2管分别加入上述反应液各1.0ml及水各1.0m1，第3管加蒸
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馏水2.0ml，然后各管均加3.0ml二硝基水杨酸溶液。置沸水浴中煮5min，取出后经自来水冷却3min，加水至25m1，混匀，以第3管调零点，于520nm处测吸光度值。以测定管的吸光度值减去对照管吸光度值，求得的差值从标准曲线上查得相应的葡萄糖含量，并乘以ll，即为每1ml酶溶液的活力。
测定管中因酶催化水解而产生的葡萄糖含量以在0.4—1.6mg之间为佳，过高或过低均应适当改变蔗糖酶溶液的浓度或反应液用量后再测。 3．底物浓度对酶促反应速度的影响——米氏常数购测定
取试管7支，按下表所示加入试剂。
当加完蔗糖溶液及pH4.5醋酸缓冲液后，均放置室温或恒温水浴(20℃或25℃)保 温5min，再分别依次向各管加入蔗糖酶溶液1.0ml，立即摇匀．记录时间。准确反应 5min，再准时加入0.1mol/L的NaOH溶液，立即摇匀，以终止反应。
测定管反应完成后，取8支洁净糖管，前7支分别加入相应的上述反应液各1.0ml及 蒸馏水各1.0ml，第8支糖管加入2.0ml蒸馏水作空白，然后各管均加入3.0ml二硝基水 杨酸溶液，沸水浴5min。取出用自来水冷却3min，稀释到25m1，混匀，于520nm处比色 测定并记录吸光度值。
对照管的测定与测定管的操作相同。 【结果处理】
根据各测定管的吸光度值(需减去相应对照管的吸光度值)，从标准曲线上查出相应的还原糖毫克数(以在0．4一1．6mg范围内为佳，否则应调整反应液用量后重新测定)，再乘以11，即得各管的产物量，然后分别计算各反应管相应的[S]、l／[S]、v及1/v，并作出v—[S]及1/v—1／[S]曲线。再根据所作的两种动力学曲线，分别求出酵母蔗糖酶的Km值，并加以比较。
上述数据可记录在下表中。
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