鱼粉中真蛋白质(非蛋白氮)的测定方法
1、适用范围：本方法适用于饲料级鱼粉中真蛋白与粗蛋白的检验。 2、原理
蛋白质在一定碱性条件下，能与重金属盐类发生盐析作用而析出沉淀，此沉淀物不溶于热水，而非蛋白氮则易溶于水，用热水洗沉淀，将水溶性含氮物洗去，剩下的沉淀物再用凯氏定氮法测定，得出真蛋白质的含量，再用真蛋白质与粗蛋白质含量之比，可判断出鱼粉中是否掺入水溶性非蛋白含氮物质。 鱼粉真蛋白质比率与指标：鱼粉蛋白质的比率以测得的真蛋白质含量与粗蛋白质含量之比来表示，粗蛋白质含量应符合产品规定，真蛋白质比率应符合：进口鱼粉中真蛋白质比率不得小于80%，国产鱼粉中真蛋白质比率不得小于75%，鱼粉真蛋白质比率小于上述值时，则判为该鱼粉中参有水溶性非蛋白含氮物质。 3、仪器设备
粉碎机、20目分样筛、分析天平（感量0.1mg）、烧杯200ml、玻璃棒、漏斗(直径10cm)、定性滤纸（中速，12.5cm，15cm)、表面皿（直径10cm）、干燥箱(可控温65--70℃)、定氮仪、容量瓶200ml、锥形瓶200或250ml、酸性滴定管25ml 4、试剂
98%浓硫酸、硫酸铜(分析纯)、硫酸铜水溶液(60g/L)、硫酸钾、400g/L氢氧化钠水溶液、12.5g/L氢氧化钠水溶液、30g/L硼酸水溶液、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂(保存期不超过3个月)、0.5N盐酸溶液、50g/L氯化钡水溶液 5、测定步骤
5.1 试样的处理 称取试样1—2g(精确到0.1mg)于250ml烧杯中，加蒸馏水100ml煮沸，加入6%的硫酸铜溶液25ml和1.25%的氢氧化钠溶液25ml，边加边搅拌，加完后继续搅拌1分钟，从电炉上取下，室温放置2h以上，沉淀物以11cm中速定性滤纸过滤，用70℃以上热水反复洗残渣，直至滤液无硫酸根离子为止(取5%氯化钡试液5滴于表面皿中，加2N盐酸1滴，滴入滤液，在黑色背景处观察应无白色沉淀)。将滤纸与残渣包好，放入烘箱，在65-75℃干燥2小时。 5.2 试样的消化
将烘干的试样连同滤纸一起放入消化管中，以下操作同粗蛋白质的测定。 5.3 空白测定： 除不加试样外其余同真蛋白质的测定。 6、计算：
真蛋白质含量的计算同粗蛋白质含量计算公式： 真蛋白质含量 真蛋白质比率(%) = ×100 粗蛋白质含量
或者用下边的方法：
先测出粗蛋白，再用TCA分离可溶蛋白
(1) 称0.5g左右的干燥试样放入125ml的锥形瓶中 (2) 加入50ml蒸馏水，静置30分钟
(3) 加入10ml10%的三氯乙酸，静置20-30分钟 (4) 用54或者541目的滤纸过滤 (5) 用三氯乙酸溶液冲洗锥形瓶两次
(6) 把残渣转移至凯氏管内测定其氮得到NPN 用CP-NPN就可以得到真蛋白
饲料特别是植物性饲料中含量较多的非蛋白氮化合物如氨化物不能或不能完全被单胃动物(如猪、禽等)利用，只有真蛋白质才能被单胃动物消化、吸收与利用。因此饲料真蛋白质含量比饲料粗蛋白含量更能反映出饲料的营养价值。下面介绍饲料中真蛋白质含量的测定方法。
一、原理
蛋白质在一定碱性条件下能与重金属盐类发生盐析作用而析出沉淀．此沉淀物不溶于热水。而非蛋白氮类物质易溶于水。用热水洗涤沉淀．将水溶性含氮物质洗去，剩下的沉淀物质再用凯氏定氮法测定即可得出饲料真蛋白质的含量。
二、测定所需的材料 1．仪器和设备
实验室用台式粉碎机、分样筛(20目)、分析天平(感量0．1mg)、烧杯(250m1)、玻璃棒、玻璃漏斗、中速定量滤纸(直径15cm)、表面皿(直径10cm)、干燥箱(可控温度65～70℃)、凯氏烧瓶(100m1)、烧煮炉或电炉、半微量定氮蒸馏器、容量瓶(100m1)、锥形瓶(250m1)、酸式滴定管(50m1)。
2．试剂与试液
硫酸AR、10％ 硫酸铜水溶液、硫酸钾或无水硫酸钠AR、氢氧化钠AR、40％ 氢氧化钠水溶液、2．5％氢氧化钠水溶液、2％ 硼酸水溶液、0．05％mo]／]盐酸标准溶液、氯化钡试液、5％氯化钡水溶液、0．1％ 甲基红乙醇溶液、0．5％ 溴甲酚绿乙醇溶液。
三、样品的选取与制备
取有代表性的样品约lkg。用四分法分为两份。一份装瓶加封作为留用样品。另一份粉碎过20目。装于广口瓶中贴标签待测。
四、测定步骤
1．试样的前处理
准确称取试样1～2g(精确到0．1mg)于250ml烧杯中，加蒸馏水50ml煮沸．依次加入10％硫酸铜水溶液20ml和25％氢氧化钠溶液20rnl，边加边搅拌，加完后继续搅拌几分钟。放置2小时或静置过夜，沉淀物以中速定量滤纸过滤。用70℃以上热水18ml反复洗涤沉淀．直至滤液无沉淀为止(取氯化钡试液滴于表面皿中。加2mol／l盐酸溶液1滴．滴人滤液．在黑色背景下观察应无白色沉淀)。然后，将滤纸和沉淀物包好，放人烘箱中在65～70℃下干燥2小时。
2．试样的消化
将烘干的试样连同滤纸一起放人凯氏烧瓶中．依次加入硫酸钾或无水硫酸钠9 硫酸铜1 浓硫酸25ml，摇匀，尔后置于电炉上先低温(100～200~C)加热，注意防止泡沫浮起，待泡沫消失后再提高加热温度(约410~C)至沸腾，消化至溶液澄清无黑点并呈蓝绿色，再继续加热30分钟，然后将凯氏烧瓶移出电炉放冷。
3．定容
将冷却后的消化液加蒸馏水约10～20ml，’摇匀后转入100ml容量瓶中，再加10～20ml蒸馏水洗涤凯氏烧瓶。溶液并入容量瓶中，如此反复洗涤，直至消化液全部转入容量瓶中。待冷却至室温后，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。即为试样分解液。
4．蒸馏
采用半微量凯氏定氮蒸馏法。先将水蒸汽发生器与半微量凯氏定氮蒸馏器连接好。在水蒸汽发生器的水中加入甲基红指示剂3滴与硫酸数滴，使水溶液保持橙红色，否则应补加少许硫酸。取20ml2％硼酸水溶液于250ml锥形瓶中，加0．1％甲基红乙醇溶液5～6滴，0．5％溴甲酚绿乙醇溶液2～3滴，摇匀。然后将锥形瓶置于半微量凯氏定氮蒸馏器的末端．使冷凝管末端浸入此吸收液面下2／3处。准确移取试样分解液10～15ml注入半微量定氮蒸馏器中，用少量蒸馏水冲洗进样口，尔后缓慢加入40％氢氧化钠水溶液20ml。用少量蒸馏水冲洗进样口，用玻璃塞塞好进样口。再加适量蒸馏水封住进样口以防止漏气。蒸馏3～5分钟以后待冷凝管末端管口之馏出液呈中性(红色石蕊试纸不变色)时将冷凝管末端离开吸收液面并冲洗冷凝管末端管口，洗液并入吸收液。再蒸馏1～2分钟后用蒸馏水冲洗冷凝管末端管口，洗液并入吸收液。然后将锥形瓶移出，准备滴定。此时应夹断气源。排出废液，准备下一个样品的测定。
5．滴定
吸收氨后的吸收液立即用0．05tool／1的盐酸标准溶液滴定使溶液颜色由蓝绿色变为灰红色即为滴定终点。同时记录盐酸标准溶液的耗用量。
6．空白