柠檬苦素的色谱检测方法研究进展
摘要：赣南脐橙主要以鲜食为主，脐橙加工业落后，其主要原因为脐橙等柑橘类汁具严重
的后苦作用，影响产品风味。其中柠檬苦素为加工中主要苦味来源。本文就柠檬苦素的色谱检测方法作简要的概述，旨在为脐橙的深加工中控制产品的质量提供一些参考。
关键词：脐橙；柠檬苦素；检测；色谱
前言
赣南是我国著名的脐橙生产基地，素有“中国脐橙之乡”之称。赣南脐橙年产量已经突破150万吨，但目前国内对脐橙的开发利用率较低，95％以上产品仍依赖鲜销；且赣州以纽荷尔脐橙为主栽品种，占种植品种的90%以上，上市集中，常常出现“丰产不丰收”，脐橙滞销，果农“卖果难”等问题。解决赣南脐橙滞销问题，最可行的办法就是大力发展脐橙深加工，而脐橙原料在深加工过程中变苦，是困扰脐橙果酒生产的难题。脐橙鲜食或其鲜榨果汁并无苦味，但压榨的橙汁在室温中存放几个小时或在冰箱中冷藏过夜，会变苦。这种脐橙果汁中的延迟苦味源于无苦味的前体物生成了柠檬苦素。据报道，脐橙等柑橘类汁出现延迟苦味的原因主要是在酸性、加热、冰冻或机械损伤等逆境环境条件下，果实中所存在的非苦味的柠檬苦素A环内酯转变成了具有强烈苦味的柠檬苦素[1]。脐橙苦味主要来自柠檬苦素类 (limonin)的变化。柠檬苦素含量的高低直接影响脐橙及其产品的品质，测定柠檬苦素的含量可用于控制脐橙及其相关产品的质量。
随着仪器分析技术的广泛应用和检测技术的发展，研究者建立了多种检测柠檬苦素类似物的方法，主要有分光光度法、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)等。
1.薄层层析法
薄层色谱法的优点是简便快捷，缺点是由于是目测，结果误差较大，所以分析重现性一直束缚着其的发展。Dreyer 在最初的柠檬苦素检测方面做出了重要贡献，1965 年，Dreyer 首次使用薄层层析法( TLC) 对柠檬苦素类似物甙元进行了定量分析，用核磁共振技术（NMR）对柠檬苦素结构的解析[2]。随后Hasegawa 和 Bennett 利用这两种方法分离、鉴定 30 种柠檬苦素苷配基和 20 种柠檬苦素配糖体[3]。
我国研究学者将参照Maier等的方法并加以改进，薄板规格为150mm×100mm，展开剂为二氯甲烷：乙酸乙醋=4:7，显色剂为二甲氨基卞亚基罗丹宁：硫酸：乙醇=1：2：97(W/W)，
展距为13.5cm，对柑橘果实提取样品中的柠檬苦素和诺米林进行定性，结果表明二者的R值分别为0.25和0.37，分离度较好[4]。为进一步揭示常山胡柚活性成分的药理作用，对胡柚皮进行综合开发利用，赵雪梅等对其有效成分的药理活性进行了研究，利用柱层析和薄层层析及现代波谱法(IR、NMR、MS)分离鉴定了常山胡柚果皮中3种化学成分的结构，试验方法为胡柚鲜皮，分别用95％和70％的乙醇回流提取后。合并提取液，减压浓缩致无醇，依次用氯仿、丙酮、乙醇和70％乙醇萃取。氯仿部位和丙酮部位反复用硅胶柱层析，Sephadex LH20凝胶层析，C 18反相柱层析，以高效薄层层析(TLC)展开，硫酸—香兰素及碘显色检测纯度，以石油醚—丙酮、氯仿—甲醇、甲醇—水等体系进行梯度洗脱，分离鉴定了30多种化合物结构，首次将柚皮素、柚皮甙、柠檬苦素这3种化学成分从该种植物中分离[5]。
2.高效液相色谱法
近年来，HPLC法广泛应用于定性定量分析的检测，由于其具有准确、高效、灵敏、时间短、重现性好、样品前处理简单等优点，所以发展很迅速。HPLC是柠檬苦素的主要测定及定量分析方法，该方法最初由Fisher创建[6]。
Soleiman 等人利用 HPLC 技术，对伊朗马赞德兰省柑橘果汁中柠檬苦素进行了定量分析，柑橘果汁中柠檬苦素的平均含量为 18.5±3.6ppm[7]。Amit Vikram 等人利用 C18 反向柱、二元溶剂梯度体系、二极管检测器，同步定量检测了柠檬苦素、诺米林等 7 种柠檬苦素苷配基和柠檬苦素配糖体，并且发现柠檬苦素和柠檬苦素葡糖苷分别是柠檬苦素苷配体和柠檬苦素配糖基的主要成分[8]。
我国利用高效液相研究柠檬苦素方面，具有大量成果。Shaojie Li和Zhuang Wang采用HPLC检测温州蜜柑中三类主要苦味物质——柠檬苦素、诺米林、柚皮苷在生长过程中含量的变化，测定柠檬苦素和诺米林时，以二氯甲烷萃取，使用 C18色谱柱，根据Manners等的方法，使用流动相配比为乙腈：10%甲醇=40:60，以 1ml/min的速度等度洗脱，210nm波长下检测；检测柚皮苷时，以纯乙腈为流动相A，10%的乙腈为流动相B，参照Ribeiro等人的洗脱方法，在285 nm波长下检测。结果表明，柠檬苦素、诺米林、柚皮苷分离效果好，检测精确度高[9]。刘亮，戚向阳等人利用 HPLC 技术对国产红葡萄柚、锦橙、酸橙和脐橙进行分析，同步分离检测柠檬苦素和诺米林两种化合物，使用 C18 反向柱，45%乙腈作为流动相，检测波长为 210nm。样品的回收率、精密度和重现性都比较好[10]。陈静等采用高效液相色谱法在KR100-5C18(4.6mm .i d.×250mm,5μm)上，分别以乙腈-四氢呋喃-水(体积比为17.5∶17.5∶65)和甲醇-冰醋酸-水(体积比为40∶1∶59)为流动相(流速均为1mL /m in)，
在207nm和283nm检测波长下分别测定了柠檬苦素和柚皮苷。实验结果表明，柠檬苦素在1.00～50.00mg /L时线性关系良好(r=0.999 2)，检出限为0.07μg，平均加标回收率为98.69%，相对标准偏差(RSD)为2.5%，用该法检测柑橘汁样品中的柠檬苦素，方法简便、快速、准确
[11]
。刘棠等用高效液相色谱法测定柠檬苦素含量，以柚子果汁为对象研究柚苷酶处理、果
汁浓缩和低温贮藏等工序对柑橘果汁中柠檬苦素含量的影响，采用的高效液相色谱条件为：进样量20 HL，柱温35℃，流动相为水(A)和乙腈(B)，以0.5 mL/min流速进行梯度洗脱，梯度条件：0～4 min，95％A：4～14 min，60％A：14～16 min，保持60％A；16～24 min，30％A：24～28 min，95％A：28～32 rnin，保持95％A；检测波长为210nm。最终实现柠檬苦素、普鲁宁、袖皮苷和柚皮素完全分离，柠檬苦素检出限为0，95 ppm/mL，定量限为3.17 ppm/mL，样品回收率为102.6％～104.2％，相对标准偏差为0.34％～1.04％[12]。
3.超高效液相
超高效液相色谱(UPLC)是分离科学中的一个全新类别，UPLC借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。国内对UPLC在柠檬苦素的检测运用方面有较多研究，建立了金柑中柠檬苦素和诺米林的UPLC检测体系，该检测体系中柠檬苦素和诺米林在1μg/mL~1780μg/mL和1μg/mL~1720 μg/mL浓度范围内呈现出良好的线性关系，R2均为0.9999，加标回收率分别为97. 19%~100. 06%和95. 35%~99. 83%，相对标准偏差(RSD)分别为
0.74%~2.25%和0.80%~3.36%，检出限分别为1.65μg/g和1.28μg/g，也可用于柑橘、柚子、橙等植物中柠檬苦素类化合物的检测[13]。将UPLC与质谱联用，检测柑橘组织中的柠檬苦素含量，具体工作条件为：色谱柱waters ACQUITY BEH C18(50mm×2.5mm,1.9μm)；流动相：A为乙腈，B为纯水，采用梯度洗脱：A10%(0min)—50%(3min) —10%(4min) —10%(5min)，流速0.3mL/min，柱温40℃，进样量5μL，检测时间5min，正离子模式（ESI+）离子检测器：柠檬苦素母离子m/z=471.1，子离子m/z=425.3，m/z=161.1[14]。
4.高效液相色谱串联技术
Manners和 Hasegawa提出的HPLC-MS法，并使用微球硅胶柱和环己烷、四氢呋喃的二元体系分离柠檬苦素类似物甙元，该方法的高选择性已经达到商业标准[15]。Gary 等人分别利用高效液相-电子轰击电离-质谱联用法（HPLC-EI/MS）和高效液相-常压化学电离-质谱联用法（HPLC-APCI/MS），对 17 种已知的中性柑橘柠檬苦素苷配基化合物进行了鉴定。已知的柠檬苦素类似物 HPLC-MS 数据提供了色谱特征信息，常压化学电离分子量数据和