实验方法原理
?/p>
1
:间接法测抗体示意图
间接法首先用抗原包被于固相载体,这些包被的抗原必须是可溶性的,或者至少是?/p>
微小的颗粒,
经洗涤,
加入含有被测抗体之标本,
再经孵育洗涤后,
加入酶标记抗抗体?/p>
(
?/p>
人的标本来说即加酶标抗人球蛋?/p>
IgG
?/p>
IgM)
,再经孵育洗涤后,加底物显色,底物降解的
量,
即为欲测抗体的量?/p>
其结果可用目测或用分光光度计定量测定?/p>
本法用同种抗原包被固
相载体后?/p>
只要用一种酶标记抗人球蛋白,
即可作多种人的传染病?/p>
寄生虫病以及其他疾病
的血清学诊断。如用酶标记抗人
IgM
,则可用于早期诊断?/p>
实验材料
血?/p>
血?/p>
体液
试剂、试剂盒
PBS
包被缓冲?/p>
硫酸
柠檬?/p>
仪器、耗材
96
孔板
酶标比色?/p>
移液?/p>
离心?/p>
离心管盒
实验步骤
一、包被抗原:用包被缓冲液稀释抗原至最适浓度(
5
?/p>
20
μ
g/ml
)各
0.3 ml
加于微反应板
每个凹孔?/p>
,4
℃过夜或
37
℃水?/p>
2
?/p>
3
小时,贮存冰箱?/p>
二、洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液(含
0.05%
吐温
-20
)洗
3
次,每次
5
分钟?/p>
三?/p>
加被检标本?/p>
每凹孔加入用含有
0.05%
吐温
-20
的稀释缓冲液稀释的被检血清各
0. 2ml
?/p>
37
℃,作用
1
?/p>
2
小时?/p>
四、洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液(含
0.05%
吐温
-20
)洗
3
次,每次
5
分钟?/p>
五、加入酶结合物:每凹孔加入稀释缓冲液稀释的酶结合物
0.2 ml 37
℃作?/p>
1
?/p>
2
小时?/p>
六、洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液(含
0.05%
吐温
-20
)洗
3
次,每次
5
分钟?/p>
七、加?/p>
0.2 ml
底物溶液于每个凹?/p>
(OPD
?/p>
OT)
,室温作?/p>
30
分钟(另作一空白对照?/p>
0.4 ml
底物?/p>
0.1 ml
终止剂)
?/p>
八、加终止剂:每凹孔加
2 M H2SO4
?/p>
2 M
柠檬?/p>
0.05 ml
?/p>
九、观察记录结果:目测或用酶标比色计测定(
OPD
?/p>
492nm
?/p>
OD
值?/p>
其他
一?/p>
ELISA
影响因素
1.
试验样品
血清、血浆或其他体液,均可作?/p>
ELISA
的试验样品(标本?/p>
。但应注意分离血清时,血?/p>
要求放置室温中凝固收缩,不宜置冰箱(
4
℃)中凝固,否则会使大部?/p>
IgM
和少?/p>
IgG
?/p>
失活性。关于人血清在保存过程中抗体的稳定性报导尚不多。但一般认为作
ELISA
血清最
好要新鲜?/p>
若要贮藏,必须少量分装保存于低温冰箱,并防止反复冻融。血浆可用肝素毛?/p>
管法采血,而血清可用滤纸片法采血?/p>
被检血清或血浆标本,可用含保护性封阻剂(吐?/p>
-20
)或称湿润剂的缓冲液来稀释。也?/p>
加入一些蛋白质,如
1%
牛血清白蛋白等来稀释。然后再加到已经用抗原或抗体包被的固?/p>
载体中进行孵育?/p>
此种被试标本可作一系列稀释度测定?/p>
也可用一个稀释度测定?/p>
对于作某
一个传染病的诊断来说,
最好先用一系列稀释度作一批标本测定,
求出对诊断有意义的一?/p>
稀释度(即测定剂量反应曲线?/p>
,然后用一个稀释测定即可。最适稀释度和孵育时间均需?