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实验?/p>

 

大肠杆菌感受态细胞的制备

 

【课前预习?/p>

 

1

、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理是什么?

 

2

、大肠杆菌感受态细胞的制备可以采用哪些方法?/p>

 

【目的要求?/p>

 

1

、了解感受态细胞生理特性及制备条件?/p>

 

2

、掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法;

 

【基本原理?/p>

 

 

所谓感受态,

是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物?/p>

只有某一生长阶段中的细菌?/p>

能作为转化的受体,能接受外源

DNA

而不将其降解的生理状态。它是由受体菌的遗传性状

所决定的,同时也受菌龄、外界环境因子的影响?/p>

cAMP

可以使感受态水平提高一万倍,?/p>

Ca

2+

也可大大促进转化的作用?/p>

细胞的感受态一般出现在对数生长期,

新鲜幼嫩的细胞是?/p>

备感受态细胞和进行成功转化的关键?/p>

感受态形成后?/p>

细胞生理状态会发生改变?/p>

出现各种

蛋白质和酶,负责供体

DNA 

的结合和加工等。细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成?/p>

接受外来?/p>

DNA 

分子的受体位点等?/p>

  

基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术,

虽然对其基本原理仍然不完全清楚,

但是

比较认同的看法是,细菌处?/p>

0

℃?/p>

CaCl

2

低渗溶液中,细胞膨胀形成球状,转化混合物?/p>

?/p>

DNA

形成?/p>

DNase

的羟?/p>

-

钙磷酸复合物粘附与细胞表面,?/p>

42

℃短时间热冲击处理,

促进细胞吸收

DNA

复合物,之后细菌在富含营养的培养基上生长,球状细胞复原并分裂?/p>

殖,

 

重组质粒在转化的细菌中,表达目的基因,因而在选择性培养基平板中,可以选出?/p>

性细菌转化子?/p>

Ca

2+

处理的感受态细胞,一般每微克

DNA

能转?/p>

10

5

-10

6

个细菌、环化的?/p>

?/p>

DNA 

愈小,转化率愈高。环化的

DNA

分子比线?/p>

DNA

分子转化率高

1000

倍?/p>

CaCl

2

转化法的优点是:简单快速,重复性好,菌株适用范围广?/p>

 

另外?/p>

电击法也可用于转化过程,

电击法不需要预先诱导细菌的感受态,

依赖短暂的电

击,利用瞬时高压电流(数千伏特)

处理细胞悬浮液,使微生物细胞膜在高压电作用下发生

去极化,

产生微孔?/p>

悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部,

转化率最?/p>

?/p>

10

9

-10

10

转化?/p>

/

μ

g

闭环

DNA

?/p>

 

制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体?/p>

15%

的无菌甘油或

-70

℃保存(有效

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实验?/p>

 

大肠杆菌感受态细胞的制备

 

【课前预习?/p>

 

1

、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理是什么?

 

2

、大肠杆菌感受态细胞的制备可以采用哪些方法?/p>

 

【目的要求?/p>

 

1

、了解感受态细胞生理特性及制备条件?/p>

 

2

、掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法;

 

【基本原理?/p>

 

 

所谓感受态,

是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物?/p>

只有某一生长阶段中的细菌?/p>

能作为转化的受体,能接受外源

DNA

而不将其降解的生理状态。它是由受体菌的遗传性状

所决定的,同时也受菌龄、外界环境因子的影响?/p>

cAMP

可以使感受态水平提高一万倍,?/p>

Ca

2+

也可大大促进转化的作用?/p>

细胞的感受态一般出现在对数生长期,

新鲜幼嫩的细胞是?/p>

备感受态细胞和进行成功转化的关键?/p>

感受态形成后?/p>

细胞生理状态会发生改变?/p>

出现各种

蛋白质和酶,负责供体

DNA 

的结合和加工等。细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成?/p>

接受外来?/p>

DNA 

分子的受体位点等?/p>

  

基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术,

虽然对其基本原理仍然不完全清楚,

但是

比较认同的看法是,细菌处?/p>

0

℃?/p>

CaCl

2

低渗溶液中,细胞膨胀形成球状,转化混合物?/p>

?/p>

DNA

形成?/p>

DNase

的羟?/p>

-

钙磷酸复合物粘附与细胞表面,?/p>

42

℃短时间热冲击处理,

促进细胞吸收

DNA

复合物,之后细菌在富含营养的培养基上生长,球状细胞复原并分裂?/p>

殖,

 

重组质粒在转化的细菌中,表达目的基因,因而在选择性培养基平板中,可以选出?/p>

性细菌转化子?/p>

Ca

2+

处理的感受态细胞,一般每微克

DNA

能转?/p>

10

5

-10

6

个细菌、环化的?/p>

?/p>

DNA 

愈小,转化率愈高。环化的

DNA

分子比线?/p>

DNA

分子转化率高

1000

倍?/p>

CaCl

2

转化法的优点是:简单快速,重复性好,菌株适用范围广?/p>

 

另外?/p>

电击法也可用于转化过程,

电击法不需要预先诱导细菌的感受态,

依赖短暂的电

击,利用瞬时高压电流(数千伏特)

处理细胞悬浮液,使微生物细胞膜在高压电作用下发生

去极化,

产生微孔?/p>

悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部,

转化率最?/p>

?/p>

10

9

-10

10

转化?/p>

/

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闭环

DNA

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制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体?/p>

15%

的无菌甘油或

-70

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大肠杆菌感受态细胞的制备

 

【课前预习?/p>

 

1

、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理是什么?

 

2

、大肠杆菌感受态细胞的制备可以采用哪些方法?/p>

 

【目的要求?/p>

 

1

、了解感受态细胞生理特性及制备条件?/p>

 

2

、掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法;

 

【基本原理?/p>

 

 

所谓感受态,

是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物?/p>

只有某一生长阶段中的细菌?/p>

能作为转化的受体,能接受外源

DNA

而不将其降解的生理状态。它是由受体菌的遗传性状

所决定的,同时也受菌龄、外界环境因子的影响?/p>

cAMP

可以使感受态水平提高一万倍,?/p>

Ca

2+

也可大大促进转化的作用?/p>

细胞的感受态一般出现在对数生长期,

新鲜幼嫩的细胞是?/p>

备感受态细胞和进行成功转化的关键?/p>

感受态形成后?/p>

细胞生理状态会发生改变?/p>

出现各种

蛋白质和酶,负责供体

DNA 

的结合和加工等。细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成?/p>

接受外来?/p>

DNA 

分子的受体位点等?/p>

  

基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术,

虽然对其基本原理仍然不完全清楚,

但是

比较认同的看法是,细菌处?/p>

0

℃?/p>

CaCl

2

低渗溶液中,细胞膨胀形成球状,转化混合物?/p>

?/p>

DNA

形成?/p>

DNase

的羟?/p>

-

钙磷酸复合物粘附与细胞表面,?/p>

42

℃短时间热冲击处理,

促进细胞吸收

DNA

复合物,之后细菌在富含营养的培养基上生长,球状细胞复原并分裂?/p>

殖,

 

重组质粒在转化的细菌中,表达目的基因,因而在选择性培养基平板中,可以选出?/p>

性细菌转化子?/p>

Ca

2+

处理的感受态细胞,一般每微克

DNA

能转?/p>

10

5

-10

6

个细菌、环化的?/p>

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DNA 

愈小,转化率愈高。环化的

DNA

分子比线?/p>

DNA

分子转化率高

1000

倍?/p>

CaCl

2

转化法的优点是:简单快速,重复性好,菌株适用范围广?/p>

 

另外?/p>

电击法也可用于转化过程,

电击法不需要预先诱导细菌的感受态,

依赖短暂的电

击,利用瞬时高压电流(数千伏特)

处理细胞悬浮液,使微生物细胞膜在高压电作用下发生

去极化,

产生微孔?/p>

悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部,

转化率最?/p>

?/p>

10

9

-10

10

转化?/p>

/

μ

g

闭环

DNA

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制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体?/p>

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实验?大肠杆菌感受态细胞的制备(? - 百度文库
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实验?/p>

 

大肠杆菌感受态细胞的制备

 

【课前预习?/p>

 

1

、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理是什么?

 

2

、大肠杆菌感受态细胞的制备可以采用哪些方法?/p>

 

【目的要求?/p>

 

1

、了解感受态细胞生理特性及制备条件?/p>

 

2

、掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法;

 

【基本原理?/p>

 

 

所谓感受态,

是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物?/p>

只有某一生长阶段中的细菌?/p>

能作为转化的受体,能接受外源

DNA

而不将其降解的生理状态。它是由受体菌的遗传性状

所决定的,同时也受菌龄、外界环境因子的影响?/p>

cAMP

可以使感受态水平提高一万倍,?/p>

Ca

2+

也可大大促进转化的作用?/p>

细胞的感受态一般出现在对数生长期,

新鲜幼嫩的细胞是?/p>

备感受态细胞和进行成功转化的关键?/p>

感受态形成后?/p>

细胞生理状态会发生改变?/p>

出现各种

蛋白质和酶,负责供体

DNA 

的结合和加工等。细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成?/p>

接受外来?/p>

DNA 

分子的受体位点等?/p>

  

基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术,

虽然对其基本原理仍然不完全清楚,

但是

比较认同的看法是,细菌处?/p>

0

℃?/p>

CaCl

2

低渗溶液中,细胞膨胀形成球状,转化混合物?/p>

?/p>

DNA

形成?/p>

DNase

的羟?/p>

-

钙磷酸复合物粘附与细胞表面,?/p>

42

℃短时间热冲击处理,

促进细胞吸收

DNA

复合物,之后细菌在富含营养的培养基上生长,球状细胞复原并分裂?/p>

殖,

 

重组质粒在转化的细菌中,表达目的基因,因而在选择性培养基平板中,可以选出?/p>

性细菌转化子?/p>

Ca

2+

处理的感受态细胞,一般每微克

DNA

能转?/p>

10

5

-10

6

个细菌、环化的?/p>

?/p>

DNA 

愈小,转化率愈高。环化的

DNA

分子比线?/p>

DNA

分子转化率高

1000

倍?/p>

CaCl

2

转化法的优点是:简单快速,重复性好,菌株适用范围广?/p>

 

另外?/p>

电击法也可用于转化过程,

电击法不需要预先诱导细菌的感受态,

依赖短暂的电

击,利用瞬时高压电流(数千伏特)

处理细胞悬浮液,使微生物细胞膜在高压电作用下发生

去极化,

产生微孔?/p>

悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部,

转化率最?/p>

?/p>

10

9

-10

10

转化?/p>

/

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闭环

DNA

?/p>

 

制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体?/p>

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