实验?/p>
大肠杆菌感受态细胞的制备
【课前预习?/p>
1
、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理是什么?
2
、大肠杆菌感受态细胞的制备可以采用哪些方法?/p>
【目的要求?/p>
1
、了解感受态细胞生理特性及制备条件?/p>
2
、掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法;
【基本原理?/p>
所谓感受态,
是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物?/p>
只有某一生长阶段中的细菌?/p>
能作为转化的受体,能接受外源
DNA
而不将其降解的生理状态。它是由受体菌的遗传性状
所决定的,同时也受菌龄、外界环境因子的影响?/p>
cAMP
可以使感受态水平提高一万倍,?/p>
Ca
2+
也可大大促进转化的作用?/p>
细胞的感受态一般出现在对数生长期,
新鲜幼嫩的细胞是?/p>
备感受态细胞和进行成功转化的关键?/p>
感受态形成后?/p>
细胞生理状态会发生改变?/p>
出现各种
蛋白质和酶,负责供体
DNA
的结合和加工等。细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成?/p>
接受外来?/p>
DNA
分子的受体位点等?/p>
基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术,
虽然对其基本原理仍然不完全清楚,
但是
比较认同的看法是,细菌处?/p>
0
℃?/p>
CaCl
2
低渗溶液中,细胞膨胀形成球状,转化混合物?/p>
?/p>
DNA
形成?/p>
DNase
的羟?/p>
-
钙磷酸复合物粘附与细胞表面,?/p>
42
℃短时间热冲击处理,
促进细胞吸收
DNA
复合物,之后细菌在富含营养的培养基上生长,球状细胞复原并分裂?/p>
殖,
重组质粒在转化的细菌中,表达目的基因,因而在选择性培养基平板中,可以选出?/p>
性细菌转化子?/p>
Ca
2+
处理的感受态细胞,一般每微克
DNA
能转?/p>
10
5
-10
6
个细菌、环化的?/p>
?/p>
DNA
愈小,转化率愈高。环化的
DNA
分子比线?/p>
DNA
分子转化率高
1000
倍?/p>
CaCl
2
转化法的优点是:简单快速,重复性好,菌株适用范围广?/p>
另外?/p>
电击法也可用于转化过程,
电击法不需要预先诱导细菌的感受态,
依赖短暂的电
击,利用瞬时高压电流(数千伏特)
处理细胞悬浮液,使微生物细胞膜在高压电作用下发生
去极化,
产生微孔?/p>
悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部,
转化率最?/p>
?/p>
10
9
-10
10
转化?/p>
/
μ
g
闭环
DNA
?/p>
制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体?/p>
15%
的无菌甘油或
-70
℃保存(有效