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试剂的作
?/p>
氯仿
的作用?
氯仿:克服酚的缺点;加速有机相与液相分层?/p>
最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中的迹量酚。(酚易溶于氯仿中)
用酚
-
氯仿抽提细胞基因?/p>
DNA
时,通常要在?/p>
-
氯仿中加少许异戊?/p>
?/p>
为什么?
异戊?/p>
:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力
?/p>
?/p>
而减少气泡产生。另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层?/p>
DNA
的水相?/p>
?/p>
间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定?/p>
用乙醇沉淀
DNA
时,为什么加入单价的
阳离?/p>
?/p>
用乙醇沉淀
DNA
时,通常要在溶液中加入单价的阳离子,?/p>
NaCl
?/p>
NaAc
?/p>
Na+
中和
DNA
分子上的负电荷,减少
DNA
分子之间的同性电荷相斥力?/p>
而易于聚集沉淀?/p>
2 DNA
提取分为三个基本步骤
每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不?/p>
?/p>
有区别?/p>
.
细胞的破?/p>
细菌有坚硬的细胞壁,首先要破碎经胞。方法有三种
;
①机械方法:超声波处?/p>
法、研磨法、匀浆法
;
②化学试剂法:用
SDS
处理细胞
;
③酶解法:加入溶菌酶?/p>
蜗牛酶,都可使细胞壁破碎?/p>
利用研磨或者超声破碎细胞,并通过加入去污剂以除掉膜脂?/p>
加入蛋白酶,醋酸盐沉淀,或者酚
/
?/p>
?/p>
抽提,以除掉细胞?/p>
?/p>
蛋白,如?/p>
DNA
结合的组蛋白?/p>
?/p>
DNA
在冷乙醇或异丙醇中沉淀,因?/p>
DNA
在醇中不可溶?/p>
黏在一起,这一步也能除掉盐分?/p>
?/p>
?/p>
,目前也有利用吸附过柱的方法提取
DNA
的商业化试剂盒?/p>
DNA
提取的几种方?/p>
(1).
浓盐?/p>
A.
利用
RNA
?/p>
DNA
在电解溶液中溶解度不
?/p>
,将二者分离,常用
?/p>
方法是用
1M
氯纳抽提
,
得到?/p>
DNA
粘液与含有少量蛋白质
氯仿一起摇?/p>
,
使乳?/p>
,
再离?/p>
除去
蛋白?/p>
,
?/p>
?/p>
蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,?/p>
DNA
位于上层水相?/p>
,
?/p>
2
?/p>
体积
95%
乙醇
可将
DNA
钠盐沉淀出来
.
B.
也可?/p>
0.15 MNaCL
液反复洗涤细胞破碎液除去
RNA,
?/p>
?/p>
1MNaCL
提取脱氧
核糖蛋白
,
再按
?/p>
?/p>
---
异醇法除去蛋?/p>
.
两种方法比较
,
?/p>
种方法使核酸降解可能少一?/p>
.