Ensembl
data bank
甲基化测?/p>
BSP
?/p>
的那个黑白点状图
(黑表示甲基化?/p>
白点表示非甲基化?/p>
?/p>
怎么做出来的呀
?/p>
?/p>
BiQ ANALYZER
软件,免费的可以下载,安装需要最新的
java
程序
,关于后续的一些步骤,我看了一篇国内的硕士论文,如下:
2.2.1.4.6
连接反应产物的转?/p>
(l)
每个连接反应准备
1
个含有氨节青霉素?/p>
LB
平板,涂板前半小时将平板从冰?/p>
中取出平衡至室温?/p>
(2)
离心使连接反应内容物汇集到管底,吸取
10ul
连接反应产物加到置于冰上?/p>
1.5ml
离心管中
.
(3)
将冻存的
JM109
高效率感受态细胞从一
70
℃冰箱中取出,放置在冰浴直至融化
(
大概
5
分钟
)
,轻轻振动离心管使之混匀?/p>
(4)
向步?/p>
2
准备的每个转化管中加?/p>
50ul
感受态细胞?/p>
(5)
轻轻振动小管混匀,冰?/p>
30
分钟?/p>
(6)
在精确的
42
℃水浴中热击
45
一
50
?/p>
(
不要振动
)
?/p>
(7)
迅速将管子移到冰浴中,使细胞冷?/p>
2
分钟?/p>
(8)
每管连接反应转化细胞中加入平衡至室温?/p>
200ulLB
培养基,
(9)
?/p>
37
℃振荡培?/p>
(150rpm)1
小时?/p>
(10)
将每个转化培养基
200ul
涂到
LB/
氨苄
/IPTG/X-Gal
平板上?/p>
(11)
将平板于
37
℃恒温箱中过夜培?/p>
(16
一
24
小时
)
?/p>
2.2.L4.7
阳性克隆筛?/p>
从培养箱中取出平板,置于
4
℃冰箱使蓝色充分显现。挑取白斑菌落到
5mLB
?/p>
基,
37
℃摇床上培养过夜。吸?/p>
lml
菌液送测序,引物为通用引物
M13
?/p>
进入丁香园,
是从?/p>
MSP
开始的?/p>
从对
DNA
甲基化的一无所知到
MSP
实验成功?/p>
经历?/p>
很多艰难,同时也收获得了不少经验。从丁香园的帖子可以看出,近几年来,国内?/p>
DNA
甲基化的研究在逐年增加,战友们在实验中遇到的困难也不少。在这里谈一下对
MSP
,
?/p>
BSP
的一点体会,希望能对新手们有所帮助,也请老手们批评补充?/p>
亚硫酸氢盐转化和
PCR
扩增?/p>
MSP
,BSP
的两个基本步骤。亚硫酸氢盐转化,估计现在做
手工修饰的也不多了,试剂盒能够很方便的帮我们解决问题。但
PCR
中的引物设计,现?/p>
可能还是个难题。看到很多帖子里提到的引物都是来源于文献的,但事实上在很多情况下?/p>
我们是没法找到现存引物的,因此掌?/p>
BSP
,MSP
引物的设计就显得非常必要了?/p>
BSP
?/p>
MSP
引物设计的一个最大问题在于亚硫酸氢盐的转化使得模板的序列复杂性大大降
低,
而且经常产生
T
?/p>
G
或者富?/p>
GC
片段交替出现的序列?/p>
这个会使引物选择变得困难?/p>
因此,往往我们需要设计巢式引物来解决这个问题?/p>
BSP
,MSP
引物的设计,除了要遵循引
物设计的基本原则外,还要注意一下一些规则: