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细胞免疫组化染色步骤

 

1

?/p>

细胞爬片?/p>

取出后,

PBS

洗三遍,

每次

3

分钟?/p>

4

℃冷丙酮固定

10

分钟?/p>

(或?/p>

4

%

多聚甲醛固定

30

分钟?/p>

,干?/p>

30

分钟?/p>

 

2. 

?/p>

PBS

洗三次,每次

5

分钟,加

3%

过氧化氢

30

μl

,室温孵?/p>

10

分钟?/p>

(以消除内源性过氧化物酶的活性)蒸馏水冲洗,

PBS

洗三次,每次

5

分钟?/p>

 

3

.加

1%

?/p>

Triton X-100 

30

μl

,室温孵?/p>

10

分钟,增加细胞膜的通透性?/p>

蒸馏水冲洗,

PBS

洗三次,每次

5

分钟?/p>

 

4

?/p>

滴加正常山羊血?/p>

30

μl

?/p>

封闭非特异性结合位点,

以消除非特异性染色,

室温孵育

30

分钟,倾去勿洗?/p>

 

5

.滴加适当稀释度的一抗,空白对照组以

PBS

代替一抗,

4

℃湿盒孵育过

夜?/p>

PBS

洗三次,每次

5

分钟?/p>

 

6

.滴加生物素标记的二抗工作液

30

μl

,室温孵?/p>

30

分钟?/p>

PBS

洗三次,

每次

5

分钟?/p>

 

7

.滴加辣根酶标记链酶卵白?/p>

30

μl

,室温孵?/p>

30

分钟?/p>

PBS

洗三次,?/p>

?/p>

5

分钟?/p>

 

8

.滴?/p>

DAB

显色?/p>

30

μl

,显微镜下观察显色,自来水冲洗?/p>

 

9. 

将处理好的玻片细胞核衬染:浸入苏木精染液染色

2min

,自来水洗,?/p>

速过盐酸酒精溶液,自来水洗,过氨水溶液,自来水洗?/p>

 

10.

梯度酒精脱水,过

70%

酒精

1

次,

95%

酒精

2

次,无水乙醇

3

次,每次

1min 

11.

二甲苯透明,过二甲苯溶?/p>

3

次,每次?/p>

min

?/p>

 

12.

中性树胶封片将有细胞的一面向下,用中性树脂封片?/p>

 

稀盐酸酒精溶液:用

75%

酒精配制

1%

盐酸?/p>

 

 

淡氨水溶液:?/p>

400ml

自来水中?/p>

2

滴浓氨水

(

使细胞核蓝化

) 

 

另外?/p>

需

1%TritonX-100

增加细胞膜通透性?/p>

苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己?/p>

索,我是?/p>

5-6

秒脱?/p>

1-2

秒?/p>

 

盐酸酒精还可?/p>

70%

乙醇配制

1%

盐酸?/p>

 

我没用淡氨水

溶液。若为悬浮细胞则需涂片?/p>

20

µ

l

即可?/p>

 

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细胞免疫组化染色步骤

 

1

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细胞爬片?/p>

取出后,

PBS

洗三遍,

每次

3

分钟?/p>

4

℃冷丙酮固定

10

分钟?/p>

(或?/p>

4

%

多聚甲醛固定

30

分钟?/p>

,干?/p>

30

分钟?/p>

 

2. 

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PBS

洗三次,每次

5

分钟,加

3%

过氧化氢

30

μl

,室温孵?/p>

10

分钟?/p>

(以消除内源性过氧化物酶的活性)蒸馏水冲洗,

PBS

洗三次,每次

5

分钟?/p>

 

3

.加

1%

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Triton X-100 

30

μl

,室温孵?/p>

10

分钟,增加细胞膜的通透性?/p>

蒸馏水冲洗,

PBS

洗三次,每次

5

分钟?/p>

 

4

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滴加正常山羊血?/p>

30

μl

?/p>

封闭非特异性结合位点,

以消除非特异性染色,

室温孵育

30

分钟,倾去勿洗?/p>

 

5

.滴加适当稀释度的一抗,空白对照组以

PBS

代替一抗,

4

℃湿盒孵育过

夜?/p>

PBS

洗三次,每次

5

分钟?/p>

 

6

.滴加生物素标记的二抗工作液

30

μl

,室温孵?/p>

30

分钟?/p>

PBS

洗三次,

每次

5

分钟?/p>

 

7

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30

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,室温孵?/p>

30

分钟?/p>

PBS

洗三次,?/p>

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5

分钟?/p>

 

8

.滴?/p>

DAB

显色?/p>

30

μl

,显微镜下观察显色,自来水冲洗?/p>

 

9. 

将处理好的玻片细胞核衬染:浸入苏木精染液染色

2min

,自来水洗,?/p>

速过盐酸酒精溶液,自来水洗,过氨水溶液,自来水洗?/p>

 

10.

梯度酒精脱水,过

70%

酒精

1

次,

95%

酒精

2

次,无水乙醇

3

次,每次

1min 

11.

二甲苯透明,过二甲苯溶?/p>

3

次,每次?/p>

min

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12.

中性树胶封片将有细胞的一面向下,用中性树脂封片?/p>

 

稀盐酸酒精溶液:用

75%

酒精配制

1%

盐酸?/p>

 

 

淡氨水溶液:?/p>

400ml

自来水中?/p>

2

滴浓氨水

(

使细胞核蓝化

) 

 

另外?/p>

需

1%TritonX-100

增加细胞膜通透性?/p>

苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己?/p>

索,我是?/p>

5-6

秒脱?/p>

1-2

秒?/p>

 

盐酸酒精还可?/p>

70%

乙醇配制

1%

盐酸?/p>

 

我没用淡氨水

溶液。若为悬浮细胞则需涂片?/p>

20

µ

l

即可?/p>

 

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1

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细胞爬片?/p>

取出后,

PBS

洗三遍,

每次

3

分钟?/p>

4

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10

分钟?/p>

(或?/p>

4

%

多聚甲醛固定

30

分钟?/p>

,干?/p>

30

分钟?/p>

 

2. 

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PBS

洗三次,每次

5

分钟,加

3%

过氧化氢

30

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,室温孵?/p>

10

分钟?/p>

(以消除内源性过氧化物酶的活性)蒸馏水冲洗,

PBS

洗三次,每次

5

分钟?/p>

 

3

.加

1%

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30

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,室温孵?/p>

10

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蒸馏水冲洗,

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5

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4

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滴加正常山羊血?/p>

30

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以消除非特异性染色,

室温孵育

30

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5

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PBS

代替一抗,

4

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夜?/p>

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洗三次,每次

5

分钟?/p>

 

6

.滴加生物素标记的二抗工作液

30

μl

,室温孵?/p>

30

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PBS

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每次

5

分钟?/p>

 

7

.滴加辣根酶标记链酶卵白?/p>

30

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30

分钟?/p>

PBS

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5

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8

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DAB

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30

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,显微镜下观察显色,自来水冲洗?/p>

 

9. 

将处理好的玻片细胞核衬染:浸入苏木精染液染色

2min

,自来水洗,?/p>

速过盐酸酒精溶液,自来水洗,过氨水溶液,自来水洗?/p>

 

10.

梯度酒精脱水,过

70%

酒精

1

次,

95%

酒精

2

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3

次,每次

1min 

11.

二甲苯透明,过二甲苯溶?/p>

3

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min

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12.

中性树胶封片将有细胞的一面向下,用中性树脂封片?/p>

 

稀盐酸酒精溶液:用

75%

酒精配制

1%

盐酸?/p>

 

 

淡氨水溶液:?/p>

400ml

自来水中?/p>

2

滴浓氨水

(

使细胞核蓝化

) 

 

另外?/p>

需

1%TritonX-100

增加细胞膜通透性?/p>

苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己?/p>

索,我是?/p>

5-6

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1-2

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盐酸酒精还可?/p>

70%

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1%

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20

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免疫组化基本步骤 - 百度文库
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细胞爬片?/p>

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洗三遍,

每次

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4

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10

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4

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30

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2. 

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5

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3%

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30

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,室温孵?/p>

10

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5

分钟?/p>

 

3

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30

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10

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5

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4

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30

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以消除非特异性染色,

室温孵育

30

分钟,倾去勿洗?/p>

 

5

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代替一抗,

4

℃湿盒孵育过

夜?/p>

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洗三次,每次

5

分钟?/p>

 

6

.滴加生物素标记的二抗工作液

30

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,室温孵?/p>

30

分钟?/p>

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洗三次,

每次

5

分钟?/p>

 

7

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30

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30

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洗三次,?/p>

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5

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8

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显色?/p>

30

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9. 

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2min

,自来水洗,?/p>

速过盐酸酒精溶液,自来水洗,过氨水溶液,自来水洗?/p>

 

10.

梯度酒精脱水,过

70%

酒精

1

次,

95%

酒精

2

次,无水乙醇

3

次,每次

1min 

11.

二甲苯透明,过二甲苯溶?/p>

3

次,每次?/p>

min

?/p>

 

12.

中性树胶封片将有细胞的一面向下,用中性树脂封片?/p>

 

稀盐酸酒精溶液:用

75%

酒精配制

1%

盐酸?/p>

 

 

淡氨水溶液:?/p>

400ml

自来水中?/p>

2

滴浓氨水

(

使细胞核蓝化

) 

 

另外?/p>

需

1%TritonX-100

增加细胞膜通透性?/p>

苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己?/p>

索,我是?/p>

5-6

秒脱?/p>

1-2

秒?/p>

 

盐酸酒精还可?/p>

70%

乙醇配制

1%

盐酸?/p>

 

我没用淡氨水

溶液。若为悬浮细胞则需涂片?/p>

20

µ

l

即可?/p>

 



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