实用汇总报å‘?/p>
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实验原理
蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上,然后利用抗原抗体反应来检测特å¼?/p>
性的蛋白分子的技术,包括三个部分ï¼?/p>
SDS
—聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质的电泳转移,免疫
印迹分析ã€?/p>
SDS
—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量,
SDS
是阴离子去污剂,能断
裂蛋白质分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏其高级结构ã€?/p>
SDS
与大多数蛋白质的ç»?/p>
合比ä¸?/p>
1.4:1
,由äº?/p>
SDS
带有大量的负电荷,与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的
电荷差别,使各种蛋白质带有相同密度的负电荷,形似长椭圆棒,蛋白迁移率与蛋白质相对åˆ?/p>
子质量的对数呈线性关系。因此,利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线,可以求得未çŸ?/p>
蛋白的相对分子质量ã€?/p>
电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中,探针分子很难通过凝胶孔,将蛋白质从凝胶转移到å›?/p>
定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。方法有两种:①水平半干式转移即将凝胶和固定åŸ?/p>
质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间,通电
10~30min
可完成②垂直湿式转移即将凝胶å’?/p>
固定基质夹在滤纸中间,浸在转移装置的缓冲液中,通电
2~4h
或过夜可完成。固定基质通常
有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜ã€?/p>
蛋白质转移到固定化膜上之后,通过蛋白质染料如丽春çº?/p>
S
检测膜上的总蛋白,或用考马
斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量,以验证转移是否成功。用抗体作为探针进行特异性的免疫å�?/p>
应检测抗原蛋白,分为
4
步:①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的è‡?/p>
由结合区,以防止作为探针的抗体结合到膜上,出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一
抗温育,使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物,
适当保温,膜上便可见到颜色反应,检测出抗原蛋白区带ã€?/p>
主要溶液
10%
分离èƒ?/p>
æ°?/p>
3.3mL
�/p>
30%
�/p>
�/p>
é…?/p>
�/p>
æ·?/p>
�/p>
æ¶?/p>
4.0mL
�/p>
1.0mol/L
Tris
ï¼?/p>
pH8.8
ï¼?/p>
2.5mL
�/p>
10%
SDS
0.1mL
�/p>
10%
过硫酸铵
0.1mL
�/p>
TEMED 0.004mL
5%
浓缩èƒ?/p>
æ°?/p>
2.7mL
�/p>
30%
丙烯酰胺混合æ¶?/p>
0.67mL
�/p>
1.0mol/LTris0.5mL
�/p>
10%SDS0.04Ml/10%
过硫酸铵
0.04mL
�/p>
TEMED0.004mL
1
×
Tris
–甘氨酸电泳缓冲æ¶?/p>
Tris
�/p>
3.03g
、甘氨酸
18.77g
�/p>
SDS 1g
,用去离子水定容è‡?/p>
1L
2
×
SDS
凝胶加样缓冲æ¶?/p>
Tris-HCl
ï¼?/p>
pH6.8
ï¼?/p>
100mmol/L
,Î?/p>
-
巯基乙醇
10%
ï¼?/p>
10%
甘油ï¼?/p>
0.01%
溴酚蓝,
10%SDS
转移缓冲æ¶?/p>
Tris 2.45g
,甘氨酸
11.25g
,甲é†?/p>
100mL
,加去离子水è‡?/p>
1L
TBST
Tris 1.21g NaCl 8.77g
ï¼?/p>
Tween-20 1mL
,加去离子水è‡?/p>
1L
Stripping
1.3mL Tris
ï¼?/p>
pH 6.8
),
4mL10%SDS
ï¼?40µlβ
-
巯基乙醇,用水定容到
20mL
实验步骤
1 SDS
—聚丙烯酰胺凝胶电泳
⑴凝胶配ç½?/p>
①分离胶的配置:将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中,至距离短玻璃板顶端约
2cm
处,停止灌胶。检查是否有气泡,若有用滤纸条吸出。然后在胶液界面上加蒸馏水进行水封ã€?/p>
15~30min
后,凝胶和水封层界面清晰,说明胶已经聚合完全,然后用滤纸吸取水封层,滤纸åˆ?/p>
勿接触到凝胶面。(使蛋白样品分离)
②浓缩胶的配置:将配置好的浓缩胶灌注在分离胶之上,直至短玻璃板的顶端,然后插入样å“?