M13
噬菌体空斑实?/p>
一、实验目的:
1
、了?/p>
M13
噬菌体载体的一般结构、性质及感染特征?/p>
2
、学习并掌握
M13
噬菌体载体的空斑纯化技术?/p>
二、实验原理:一?/p>
M13
噬菌体的病毒颗粒感染一个细菌后形成一个噬菌斑。从感染细菌
释放出来的子代病毒颗粒感染临近细菌,
后者又可释放下一代病毒颗粒;
如果细菌在半固体
培养基上生长?/p>
自带病毒颗粒的扩散受到一定限制,
诸如
M13
等丝状噬菌体并不裂解细菌?/p>
但可以使细菌生长速度降低至原来的
1/2
,在上层琼脂中生长的菌台的背景下,生长缓慢细
菌形成了一个不断扩大到肉眼可见的噬菌斑?/p>
三、材料与试剂?/p>
1
?/p>
M13
噬菌?/p>
2
?/p>
ER2738
菌种
3
?/p>
LB
培养?/p>
四、实验步?/p>
1.
1
、取
5ml LB
液体培养基于
10ml
的试管中,加?/p>
5ul
四环素(
20mg/ml
?/p>
,将大肠杆菌
接入?/p>
3
7
℃震荡(
80-100rpm
)培养过夜(
12h
?/p>
2.
?/p>
2ml
?/p>
ER2738
培养液转?/p>
20ml
?/p>
LB
培养基中?/p>
1:10
稀释)
,继?/p>
3
7
℃震?/p>
?/p>
80-100rpm
)培?/p>
4.5h
(不宜过快,否则,细菌性毛被破坏,噬菌体无法导入)
,即
成为感受态细?/p>
3.
培养细菌时将水浴锅打开?/p>
43
℃预热,并将
LB
平板置于
37
℃预热备?/p>
4.
用装?/p>
LB
培养基的
EP
?/p>
10
倍稀释噬菌体?/p>
理想的稀释范围:
扩增过的噬菌?/p>
10
8
-10
10
倍稀释,未扩增过?/p>
10
4
-10
5
倍稀?/p>
5.
将顶层琼脂用微波炉或者电磁炉沸水融化,置于水浴锅中保温待?/p>
6.
当大肠杆菌达到对数成长期,取大肠杆菌
ER2738
感受态细?/p>
200ul
?/p>
EP
管中
7.
加入
10ul-100
ul
?/p>
或者一定体积)
一定稀释度的噬菌体溶液?/p>
快速混合,
室温孵育
1-5min
8.
将感染过的大肠杆菌的培养液倒入
43
℃顶层琼脂中,用
vortex
迅速混匀,立刻在预热
?/p>
LB
培养基上倒平板,迅速摇晃平板使顶层琼脂均匀展开并铺满表?/p>
9.
室温静置
5min
左右使平板冷却凝固,将培养皿倒置
37
℃培养过?/p>
10.
第二天观察平板,对培养皿中的噬菌斑进行计数,计算约含?/p>
10-100
个数量级的平?
噬菌斑的具体数目?/p>
y
?/p>
,计算噬菌体效价?/p>
pfu/ml
)噬菌体效价
=y*10
x+2
puf/ml