?/p>
Hanahan
方法制备感受态细胞——高效转?/p>
DMSO
DnD
溶液
转化缓冲液:
标准转化缓冲液:用于制备现用的感受态细?/p>
1M
MES(pH6.3):
?/p>
19.52
?/p>
MES
溶于
80mL
超纯水中?/p>
?/p>
KOH
调节
pH
?/p>
6.3,
用超纯水定容?/p>
100mL,
0.45um
孔径的滤膜过滤除菌,分成小份
-20
℃保?/p>
;
试剂
需要量
/L
终浓?/p>
1M MES(pH6.3)
MnCl2 4H2O
CaCl2 2H2O
KCl
氯化六氨合高?/p>
H2O
10mL
8.91g
1.47g
7.46g
0.8g
定容?/p>
1L
10mM
45mM
10mM
100mM
3mM
0.45um
孔径的滤膜过滤除菌,分装?/p>
4
℃保存?/p>
冻存缓冲液(
FSB
?/p>
1M
KAc:
?/p>
9.82g
KAc90mL
的超纯水中,?/p>
2M
的醋酸将
pH
调至
7.5
,并用超纯水定容?/p>
100mL,
分装成小份保?/p>
?/p>
-20
?/p>
;
试剂
需要量
/L
终浓?/p>
1M KAc(pH7.5)
MnCl2 4H2O
CaCl2 2H2O
KCl
氯化六氨合高?/p>
甘油
0.1N HCl
H2O
10mL
8.91g
1.47g
7.46g
0.8g
100mL
定容?/p>
1L
10mM
45mM
10mM
100mM
3mM
10%(V/V)
?/p>
pH
?/p>
6.4
0.4um
滤膜过滤,分装并保存?/p>
4
℃(在保存过程中?/p>
pH
会降低至
6.1-6.2
,之后就稳定在这个水平)
LB
培养?/p>
1
?/p>
LB
无抗培养基倒平板,划线培养大肠杆菌过夜
;
2
?/p>
挑取单菌落,接种?/p>
3mL
?/p>
LB
培养基中?/p>
37
℃?/p>
250
?/p>
300rpm/min
培养
6-8h
?/p>
3
?/p>
将上述培养物接种?/p>
250mLLB
培养基的
1L
三角瓶中?/p>
37
℃振荡培?/p>
3h
左右?/p>
4
?/p>
将培养物转移至无菌、预冷的离心管内,冰?/p>
10min
?/p>
5
?/p>
4
?/p>
2700g
离心
10min
收集菌体?/p>
6
?/p>
弃去培养液,将离心管倒扣在吸水纸上吸干剩余液体;