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?/p>

Hanahan

方法制备感受态细胞——高效转?/p>

 

DMSO 

DnD 

溶液

 

转化缓冲液:

 

标准转化缓冲液:用于制备现用的感受态细?/p>

 

1M 

MES(pH6.3):

?/p>

19.52

?/p>

MES

溶于

80mL

超纯水中?/p>

?/p>

KOH

调节

pH

?/p>

6.3,

用超纯水定容?/p>

100mL, 

0.45um

孔径的滤膜过滤除菌,分成小份

-20

℃保?/p>

; 

试剂

 

需要量

/L 

终浓?/p>

 

1M MES(pH6.3) 

MnCl2 4H2O 

CaCl2 2H2O 

KCl 

氯化六氨合高?/p>

 

H2O 

10mL 

8.91g 

1.47g 

7.46g 

0.8g 

定容?/p>

1L 

10mM 

45mM 

10mM 

100mM 

3mM 

0.45um

孔径的滤膜过滤除菌,分装?/p>

4

℃保存?/p>

 

冻存缓冲液(

FSB

?/p>

 

1M 

KAc:

?/p>

9.82g 

KAc90mL

的超纯水中,?/p>

2M

的醋酸将

pH

调至

7.5

,并用超纯水定容?/p>

100mL,

分装成小份保?/p>

?/p>

-20

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; 

试剂

 

需要量

/L 

终浓?/p>

 

1M KAc(pH7.5) 

MnCl2 4H2O 

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氯化六氨合高?/p>

 

甘油

 

0.1N HCl 

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8.91g 

1.47g 

7.46g 

0.8g 

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定容?/p>

1L 

10mM 

45mM 

10mM 

100mM 

3mM 

10%(V/V) 

?/p>

pH

?/p>

6.4 

0.4um 

滤膜过滤,分装并保存?/p>

4

℃(在保存过程中?/p>

pH

会降低至

6.1-6.2

,之后就稳定在这个水平)

 

LB

培养?/p>

 

1

?/p>

 

LB

无抗培养基倒平板,划线培养大肠杆菌过夜

; 

2

?/p>

 

挑取单菌落,接种?/p>

3mL

?/p>

LB

培养基中?/p>

37

℃?/p>

250

?/p>

300rpm/min

培养

6-8h

?/p>

 

3

?/p>

 

将上述培养物接种?/p>

250mLLB

培养基的

1L

三角瓶中?/p>

37

℃振荡培?/p>

3h

左右?/p>

 

4

?/p>

 

将培养物转移至无菌、预冷的离心管内,冰?/p>

10min

?/p>

 

5

?/p>

 

4

?/p>

2700g

离心

10min

收集菌体?/p>

 

6

?/p>

 

弃去培养液,将离心管倒扣在吸水纸上吸干剩余液体;

 

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Hanahan

方法制备感受态细胞——高效转?/p>

 

DMSO 

DnD 

溶液

 

转化缓冲液:

 

标准转化缓冲液:用于制备现用的感受态细?/p>

 

1M 

MES(pH6.3):

?/p>

19.52

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MES

溶于

80mL

超纯水中?/p>

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KOH

调节

pH

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6.3,

用超纯水定容?/p>

100mL, 

0.45um

孔径的滤膜过滤除菌,分成小份

-20

℃保?/p>

; 

试剂

 

需要量

/L 

终浓?/p>

 

1M MES(pH6.3) 

MnCl2 4H2O 

CaCl2 2H2O 

KCl 

氯化六氨合高?/p>

 

H2O 

10mL 

8.91g 

1.47g 

7.46g 

0.8g 

定容?/p>

1L 

10mM 

45mM 

10mM 

100mM 

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孔径的滤膜过滤除菌,分装?/p>

4

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冻存缓冲液(

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1M 

KAc:

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9.82g 

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的超纯水中,?/p>

2M

的醋酸将

pH

调至

7.5

,并用超纯水定容?/p>

100mL,

分装成小份保?/p>

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-20

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试剂

 

需要量

/L 

终浓?/p>

 

1M KAc(pH7.5) 

MnCl2 4H2O 

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甘油

 

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8.91g 

1.47g 

7.46g 

0.8g 

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滤膜过滤,分装并保存?/p>

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℃(在保存过程中?/p>

pH

会降低至

6.1-6.2

,之后就稳定在这个水平)

 

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培养?/p>

 

1

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无抗培养基倒平板,划线培养大肠杆菌过夜

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2

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挑取单菌落,接种?/p>

3mL

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培养基中?/p>

37

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培养

6-8h

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3

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将上述培养物接种?/p>

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培养基的

1L

三角瓶中?/p>

37

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3h

左右?/p>

 

4

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将培养物转移至无菌、预冷的离心管内,冰?/p>

10min

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2700g

离心

10min

收集菌体?/p>

 

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弃去培养液,将离心管倒扣在吸水纸上吸干剩余液体;

 

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方法制备感受态细胞——高效转?/p>

 

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溶液

 

转化缓冲液:

 

标准转化缓冲液:用于制备现用的感受态细?/p>

 

1M 

MES(pH6.3):

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19.52

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溶于

80mL

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调节

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用超纯水定容?/p>

100mL, 

0.45um

孔径的滤膜过滤除菌,分成小份

-20

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; 

试剂

 

需要量

/L 

终浓?/p>

 

1M MES(pH6.3) 

MnCl2 4H2O 

CaCl2 2H2O 

KCl 

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10mL 

8.91g 

1.47g 

7.46g 

0.8g 

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1L 

10mM 

45mM 

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4

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1M 

KAc:

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9.82g 

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调至

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-20

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; 

试剂

 

需要量

/L 

终浓?/p>

 

1M KAc(pH7.5) 

MnCl2 4H2O 

CaCl2 2H2O 

KCl 

氯化六氨合高?/p>

 

甘油

 

0.1N HCl 

H2O 

10mL 

8.91g 

1.47g 

7.46g 

0.8g 

100mL 

 

定容?/p>

1L 

10mM 

45mM 

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100mM 

3mM 

10%(V/V) 

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pH

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6.4 

0.4um 

滤膜过滤,分装并保存?/p>

4

℃(在保存过程中?/p>

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会降低至

6.1-6.2

,之后就稳定在这个水平)

 

LB

培养?/p>

 

1

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LB

无抗培养基倒平板,划线培养大肠杆菌过夜

; 

2

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挑取单菌落,接种?/p>

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37

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3

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将上述培养物接种?/p>

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3h

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10min

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10min

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制备感受态细?- 百度文库
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溶液

 

转化缓冲液:

 

标准转化缓冲液:用于制备现用的感受态细?/p>

 

1M 

MES(pH6.3):

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19.52

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溶于

80mL

超纯水中?/p>

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100mL, 

0.45um

孔径的滤膜过滤除菌,分成小份

-20

℃保?/p>

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试剂

 

需要量

/L 

终浓?/p>

 

1M MES(pH6.3) 

MnCl2 4H2O 

CaCl2 2H2O 

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10mL 

8.91g 

1.47g 

7.46g 

0.8g 

定容?/p>

1L 

10mM 

45mM 

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3mM 

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孔径的滤膜过滤除菌,分装?/p>

4

℃保存?/p>

 

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1M 

KAc:

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7.5

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100mL,

分装成小份保?/p>

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-20

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需要量

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1M KAc(pH7.5) 

MnCl2 4H2O 

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甘油

 

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10mL 

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10%(V/V) 

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pH

?/p>

6.4 

0.4um 

滤膜过滤,分装并保存?/p>

4

℃(在保存过程中?/p>

pH

会降低至

6.1-6.2

,之后就稳定在这个水平)

 

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培养?/p>

 

1

?/p>

 

LB

无抗培养基倒平板,划线培养大肠杆菌过夜

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2

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挑取单菌落,接种?/p>

3mL

?/p>

LB

培养基中?/p>

37

℃?/p>

250

?/p>

300rpm/min

培养

6-8h

?/p>

 

3

?/p>

 

将上述培养物接种?/p>

250mLLB

培养基的

1L

三角瓶中?/p>

37

℃振荡培?/p>

3h

左右?/p>

 

4

?/p>

 

将培养物转移至无菌、预冷的离心管内,冰?/p>

10min

?/p>

 

5

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4

?/p>

2700g

离心

10min

收集菌体?/p>

 

6

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弃去培养液,将离心管倒扣在吸水纸上吸干剩余液体;

 



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  • ʹICD-10ʼ
  • S7-300400 PLC̹淶
  • ѧ[2008]1
  • н蹤̵ձ׼DBJ 50-129-2011
  • ϰ⣨𰸣
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