实验十一
凝胶层析法测定蛋白质分子?/p>
实验目的?/p>
了解凝胶层析的原理及其操作,分离血红蛋白和胰蛋白酶(或蓝葡聚糖
2000
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实验原理?/p>
凝胶层析也成凝胶过滤法,排阻层析、分子筛层析或渗透层析等?/p>
20
世纪
60
年代发展起来?/p>
一种简便有效的生物化学分离分析方法。这种方法的
基本原理
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用一般的柱层析方法使相对分子?/p>
量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相(凝胶)
,从而使物质分离
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用作凝胶的材料有多种?/p>
如交联葡聚糖?/p>
琼脂糖?/p>
聚丙烯酰胺凝胶?/p>
聚苯乙烯和多孔玻璃珠等?/p>
以交联葡聚糖分离物质和测定相对分子量为例说明凝胶层析法的基本原理和应用?/p>
交联葡聚糖(
Sephadex
)是由细菌葡聚糖(以右旋葡萄糖为残基的多糖)用交联剂环氧氯丙?/p>
交联形成的有三维空间的网状结构物?/p>
控制葡聚糖和交联剂的配比及反应条件就可决定其交联度的
大小(交联度大,
“网眼”就小)
,从而得到各种规格的交联葡聚糖,即不同型号的凝胶
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G
”表?/p>
交联度,
G
越小,交联度越大,吸水量也就越小,见?/p>
3-3
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P.41.
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G
值越小,颗粒比较硬,
G
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越大,颗粒相比较软些(可以以手感触)
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G
值也对应凝胶的工作范围?/p>
凝胶层析广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等,而测定蛋白质的分?/p>
量也是它的重要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来
分离物质?/p>
主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子
(近于球形)
具有不同的排阻效应实现的
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亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的?/p>
对于某种型号的凝胶,一些大分子不能进入
凝胶颗粒内部而完全被排阻在外,洗脱时,此类物质沿着颗粒间隙下移,最先流出层析柱(板书:
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3-14
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3-15A
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。而一些小分子不被排阻,可自由扩散,渗透进入凝胶内部的筛孔,尔后又被流?/p>
的洗脱液带走。分子越小,进入凝胶内部越深,在凝胶颗粒的网孔内滞留的时间越长,结果是小?/p>
子的蛋白质洗脱速度较慢,即洗脱体积较大,最后流出柱外。不同一些中等大小的分子介于大分?/p>
与小分子之间,只能进入一部分凝胶较大的孔隙,亦即部分排阻,因此这些分子从柱中流出的顺?/p>
也介于大、小分子之间。不同分子质量蛋白质的洗脱体积也不相同,通过部分收集器可以将它们?/p>
集在不同的洗脱组分中?/p>
Spladex
G-10
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G-50
通常用于分离肽或脱盐?/p>
G-75
?/p>
G-200
可用于分?/p>
相对分子质量大于
10000
的蛋白质?/p>