实验一
载体与目的基因的连接与转化以?/p>
重组
DNA
的提取与酶切鉴定
一、实验目?/p>
1.CaCl
2
法制备感受态细?/p>
2.
目的基因与载体连接(
c-myc+pSV2
;粘端连接)
3.
重组质粒转化大肠杆菌并筛选转化体?/p>
HB101
?/p>
Amp
r
?/p>
4.
质粒
DNA
的小量快速制?/p>
5.
质粒
DNA
的限制性内切酶酶切
6.DNA
的琼脂糖凝胶电泳
二、实验原?/p>
通过粘端连接法将具有相同粘性末端的
DNA
分子连接在一起,通过碱基?/p>
对氢键形成一个相对稳定的结构?/p>
利用连接酶发挥间断修复的功能?/p>
从而获得重
组的
DNA
分子?/p>
受体细胞经处理后
(电击或
CaCl
2
等处理)
?/p>
细胞膜通透性发生变化,
从而使
外源的载体分子通过感受态细胞,
并使受体细胞获得新的稳定遗传的性状?/p>
该过
程称为转化。由于本实验?/p>
pSV
带有抗氨苄青霉素的基因,因而转化后的细?/p>
在含氨苄青霉素的平板上培养可以筛选出转化成功的受体细胞?/p>
分离质粒
DNA
的步骤包括:培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌以及?/p>
离和纯化质粒
DNA
?/p>
SDS
可以使细胞壁裂解,碱变性抽提质?/p>
DNA
的原理是
利用染色?/p>
DNA
与质?/p>
DNA
的变性复性的差异达到分离目的?/p>
?/p>
pH
?/p>
12.6
时,
染色?/p>
DNA
氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,质粒
DNA
由于超螺旋共价闭
合环状结构,
两条互补链不会完全分离?/p>
当采?/p>
pH 4.8
?/p>
NaAc
高盐缓冲液调?/p>
pH
至中性时,质?/p>
DNA
恢复原有的构型,而染色体
DNA
则不能复性而缠绕形
成网状结构。通过离心可将染色?/p>
DNA
及大分子
RNA
、蛋白质等去除?/p>
三、实验器材和试剂
?/p>
.
器材
恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴、台式离心机、低温离心机、涡
旋振荡器、移液枪及枪头?/p>
1.5 ml
离心管、制冰机、三角推棒、酒精灯、细菌培