流式细胞术检测淋巴细胞表面标?/p>
一、实验目?/p>
1.
了解流式细胞仪的组成?/p>
原理及应用:
初步了解流式细胞仪的工作元件及基本应用原
理;能够认识流式细胞术的应用,特别是常用的一些功能?/p>
2.
熟悉用流式细胞术检测小鼠脾?/p>
T
细胞表面标志的基本流?/p>
3.
学习并掌握流式细胞术结果的分析:能够基本看懂结果图,重点掌握“门”和“补
偿”两个概念?/p>
二、实验原?/p>
1.
流式细胞?/p>
?/p>
Flow
Cytometry,
简?/p>
FCM
?/p>
是一种可以快速?/p>
准确、客观,
并且同时
检测单个微?/p>
(通常是细胞)
的多项特?/p>
(多参数?/p>
的技术,
同时可以对特定群体加以分选?/p>
特点:可检测的样本种类多样,大小范围较广(0.2~50µm?/p>
;检测速度快,分析样本?/p>
大(快速、大量)
;细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏;采用激光作为激发光源,
保证其具有更好的单色性与激发效率;
利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术,
?/p>
证检测的灵敏度和特异性;
用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进
行数据处理分析,保证了检测速度
10000
个细?/p>
(
微粒
)/
秒与统计分析精确性?/p>
2.
流式细胞仪组成及原理
Fluidics (
液流系统
)
——流体动力学聚焦样本形成单细胞流?/p>
鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液?/p>
主要作用是包裹样本流的周围,
保持样本流中
细胞处于喷嘴中心位置?/p>
防止其靠近孔壁而阻塞喷孔?/p>
匀速流动,
保证每个细胞通过激光照
射区的时间相等,从而得到准确的细胞荧光信息?/p>
Optics (
光学系统
)
——激发和收集光信号?/p>
激发系统包括:激光器、透镜和反射镜,将激光聚焦到检测区
收集系统包括:光学镜片和滤光片、光信号检测器
流式细胞仪收集的信号?/p>
?/p>
1
)散射光信号:细胞在液柱中与激光束相交时向周围
360
°
立体角方向散射的光线信号,它的强弱与细胞的大小、形状?/p>
胞内颗粒折射等有关,主要?/p>
为前向散射光
(
信号强弱与细胞体积大小成正比
)
和侧向散射光
(
检测细胞粒度和细胞内相?/p>
复杂?/p>
)
?/p>
FS-SS
图可对未染色的活细胞进行分析或分选,但不能分析表面分子(
2
)荧光信
号:
荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生?/p>
发射的荧光波长与激发光
波长不同?/p>
每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色,
通过波长选择通透性滤片,
可将?/p>
同波长的散射光和荧光信号区分开?/p>
送入不同的光电倍增管;
选择不同的单抗及染料就可?/p>
时测定一个细胞上的多个不同特征?/p>
Electronics
(
电子系统
)
——数据处理系统,扩大信号,将光信号转化为电信号,处理
信号并存储于电脑?/p>
3.
流式步骤
第一步:
用带有不同荧光基团的抗体分别识别并结合细胞上不同抗原
(染色)
?/p>
第二步:
带有荧光的细胞一个接一个通过激光;
第三步:
不同荧光基团有不同发射光谱,
荧光染料?/p>
择原则:
必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发?/p>
激发光谱必须在仪器上滤光片?/p>
够接受的合适范围内?/p>
荧光素光谱的重叠应当尽量减少?/p>
第四步:
复杂的荧光信号被不同?/p>
色镜和滤光片分解;第五步:光电倍增管(
PMT
)将光信号变成电信号;第六步:模数变?/p>
器(
ADC
)进一步将模拟信号变成计算机能处理的数字信?/p>
4.
分选基本原?/p>
细胞悬液形成液流柱→压电晶体产生机械振动?/p>
流动室振动→液流断裂成液滴→如果?