MDC:
?/p>
12 mg
粉末溶于
720 nl DMSO
使其浓度?/p>
50 mmol/L,
分装?/p>
-
20
冰箱保存?/p>
临用前用
MEM
稀释到终浓?/p>
50 umol/L;
Rapamycin:
?/p>
MEM
培养基配成终浓度?/p>
1 umol/L,
现用现配
;
400ng/ml
喹乙?/p>
:
称取
4 mg
喹乙?/p>
,DMSO
预溶
(
体积
<0.1%)
后加?/p>
10 ml MEM
培养液至完全
溶解
,
现用现配
,
避光保存
;
3
-
MA:
首先?/p>
PBS
溶解粉末
,
临用前加热至完全溶解后再加入
MEM
培养基至终浓?/p>
10mmol/L;
PI3K
抑制?/p>
?/p>
3
-
MA
?/p>
Wortmannin
)可干扰或阻断自
?/p>
体的形成
?/p>
RAPAMYCIN
诱导自噬我也查过一部分文献,有用无血清的,也有用,一般培养基的,浓度
?/p>
25nM
?/p>
100nM
都有,用的是
50nM
的雷帕霉素,加入一般的培养基中,目的是排除无血?/p>
所诱导出来的自噬?/p>
文献说饥饿初期激活的是大分子自噬,在
4
-
6
小时活力达到最大,
24h
后以
CMA
途径为主
Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h
sigma
?/p>
EBSS
,货?/p>
E2888
,有碳酸氢钠,有酚红的,酚红到不是很必须,只是一?/p>
PH
指示
作用,好看些
无血清诱导自噬:
EBSS
诱导
6
个小时就可以了?/p>
EBSS
一定可以诱导出来,
只是需要说明的是时间点的设置,
因为从饥饿诱导开始半个小时就?/p>
能开始自噬了,一直到
24
小时都持续,所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很
大的问题是,
饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡,
这也是我面临的问题,
就是在细胞收养的
时候蛋白浓度太小了?/p>
24
小时就很少了,更不要?/p>
48
小时?/p>
72
小时?/p>
Hank's
诱导?/p>
也就是通常所说的饥饿诱导?/p>
细胞培养到对数生长期后以
Hank's
替代常规完全?/p>
养基?/p>
3h
后就可诱导出自噬
?/p>
我用
Hank's
诱导?/p>
3h
后电镜观察有
30%
细胞都有自噬这种现象?/p>
但不如国外报道的高?/p>
sigma
的氯喹的货号
C6628
?/p>
用氯喹做自噬抑制剂,
293T
细胞
50uM
就可以?/p>
1.
可以用双蒸水
配制
2.
配制?/p>
4
度保?/p>
不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑?/p>
lc3
的剪切,但能抑制后续的步
骤,
Chloroquine
抑制自噬体与溶酶体的融合过程?/p>
autophgy
不能完成,所?/p>
lc3
才会累积?/p>
因此加了抑制?/p>
lc3
之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中?/p>
pH
值,使溶酶体中的酸性水
解酶丧失活性,从而导致“自噬溶酶体”不能降解,因此,位于自噬体和自噬溶酶体膜上?/p>
LC3
不能按时降解,表现为
LC3
荧光长时间的保留?/p>
WB
?/p>
LC3
条带变粗?/p>
Z-VAD-FMK
?/p>
caspase-3
抑制剂)
抑制
EV71
感染所引起的细胞凋亡,
观察细胞的自噬情况?/p>
研究发现,抑制细胞凋亡能增加
LC3-I
转化?/p>
LC3-II
以及
p62
的降解?/p>
1.
雷帕霉素:作为以
mTOR
为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用,推荐工作浓度?/p>
1
μ
mol
-
10
μ
mol
?/p>
2.
氯喹:氯喹(
Chloroquine
)作为溶酶体的抑制剂,可以抑制自噬体与溶酶体的融合从
而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究,推荐使用浓度:
10umol
-
50umol
?/p>
正常培养的细胞自噬活性很低,不适于观察?/p>
因此,必须对自噬进行人工干预和调节,
经报道的