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MDC:

?/p>

12 mg

粉末溶于

720 nl DMSO

使其浓度?/p>

50 mmol/L,

分装?/p>

-

20

冰箱保存?/p>

 

临用前用

MEM

稀释到终浓?/p>

50 umol/L;

 

 

Rapamycin:

?/p>

MEM

培养基配成终浓度?/p>

1 umol/L,

现用现配

;

 

400ng/ml

喹乙?/p>

:

称取

4 mg

喹乙?/p>

,DMSO

预溶

(

体积

<0.1%)

后加?/p>

10 ml MEM

培养液至完全

溶解

,

现用现配

,

避光保存

;

 

 

3

-

MA:

首先?/p>

PBS

溶解粉末

,

临用前加热至完全溶解后再加入

MEM

培养基至终浓?/p>

10mmol/L;

 

PI3K

抑制?/p>

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3

-

MA

?/p>

Wortmannin

)可干扰或阻断自

?/p>

体的形成

 

 

?/p>

RAPAMYCIN

诱导自噬我也查过一部分文献,有用无血清的,也有用,一般培养基的,浓度

?/p>

25nM

?/p>

100nM

都有,用的是

50nM

的雷帕霉素,加入一般的培养基中,目的是排除无血?/p>

所诱导出来的自噬?/p>

 

 

文献说饥饿初期激活的是大分子自噬,在

4

-

6

小时活力达到最大,

24h

后以

CMA

途径为主

 

Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h

 

sigma

?/p>

EBSS

,货?/p>

E2888

,有碳酸氢钠,有酚红的,酚红到不是很必须,只是一?/p>

PH

指示

作用,好看些

 

无血清诱导自噬:

EBSS 

诱导

6

个小时就可以了?/p>

 

EBSS

一定可以诱导出来,

只是需要说明的是时间点的设置,

因为从饥饿诱导开始半个小时就?/p>

能开始自噬了,一直到

24

小时都持续,所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很

大的问题是,

饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡,

这也是我面临的问题,

就是在细胞收养的

时候蛋白浓度太小了?/p>

24

小时就很少了,更不要?/p>

48

小时?/p>

72

小时?/p>

 

Hank's

诱导?/p>

也就是通常所说的饥饿诱导?/p>

细胞培养到对数生长期后以

Hank's

替代常规完全?/p>

养基?/p>

3h

后就可诱导出自噬

?/p>

我用

Hank's

诱导?/p>

3h

后电镜观察有

30%

细胞都有自噬这种现象?/p>

但不如国外报道的高?/p>

 

 

sigma

的氯喹的货号

C6628

?/p>

用氯喹做自噬抑制剂,

293T

细胞

50uM

就可以?/p>

1. 

可以用双蒸水

配制

2. 

配制?/p>

4

度保?/p>

 

不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑?/p>

lc3

的剪切,但能抑制后续的步

骤,

Chloroquine

抑制自噬体与溶酶体的融合过程?/p>

autophgy

不能完成,所?/p>

lc3

才会累积?/p>

 

因此加了抑制?/p>

lc3

之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中?/p>

pH

值,使溶酶体中的酸性水

解酶丧失活性,从而导致“自噬溶酶体”不能降解,因此,位于自噬体和自噬溶酶体膜上?/p>

LC3

不能按时降解,表现为

LC3

荧光长时间的保留?/p>

WB

?/p>

LC3

条带变粗?/p>

 

 

Z-VAD-FMK

?/p>

caspase-3 

抑制剂)

抑制

EV71

感染所引起的细胞凋亡,

观察细胞的自噬情况?/p>

研究发现,抑制细胞凋亡能增加

LC3-I

转化?/p>

LC3-II

以及

p62

的降解?/p>

 

 

1. 

 

 

雷帕霉素:作为以

mTOR 

为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用,推荐工作浓度?/p>

1

μ

mol

-

10

μ

mol

?/p>

 

 

2. 

 

 

氯喹:氯喹(

Chloroquine

)作为溶酶体的抑制剂,可以抑制自噬体与溶酶体的融合从

而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究,推荐使用浓度:

10umol

-

50umol

?/p>

 

 

正常培养的细胞自噬活性很低,不适于观察?/p>

因此,必须对自噬进行人工干预和调节,

经报道的

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12 mg

粉末溶于

720 nl DMSO

使其浓度?/p>

50 mmol/L,

分装?/p>

-

20

冰箱保存?/p>

 

临用前用

MEM

稀释到终浓?/p>

50 umol/L;

 

 

Rapamycin:

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培养基配成终浓度?/p>

1 umol/L,

现用现配

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400ng/ml

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)可干扰或阻断自

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体的形成

 

 

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诱导自噬我也查过一部分文献,有用无血清的,也有用,一般培养基的,浓度

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25nM

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100nM

都有,用的是

50nM

的雷帕霉素,加入一般的培养基中,目的是排除无血?/p>

所诱导出来的自噬?/p>

 

 

文献说饥饿初期激活的是大分子自噬,在

4

-

6

小时活力达到最大,

24h

后以

CMA

途径为主

 

Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h

 

sigma

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EBSS

,货?/p>

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,有碳酸氢钠,有酚红的,酚红到不是很必须,只是一?/p>

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指示

作用,好看些

 

无血清诱导自噬:

EBSS 

诱导

6

个小时就可以了?/p>

 

EBSS

一定可以诱导出来,

只是需要说明的是时间点的设置,

因为从饥饿诱导开始半个小时就?/p>

能开始自噬了,一直到

24

小时都持续,所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很

大的问题是,

饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡,

这也是我面临的问题,

就是在细胞收养的

时候蛋白浓度太小了?/p>

24

小时就很少了,更不要?/p>

48

小时?/p>

72

小时?/p>

 

Hank's

诱导?/p>

也就是通常所说的饥饿诱导?/p>

细胞培养到对数生长期后以

Hank's

替代常规完全?/p>

养基?/p>

3h

后就可诱导出自噬

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我用

Hank's

诱导?/p>

3h

后电镜观察有

30%

细胞都有自噬这种现象?/p>

但不如国外报道的高?/p>

 

 

sigma

的氯喹的货号

C6628

?/p>

用氯喹做自噬抑制剂,

293T

细胞

50uM

就可以?/p>

1. 

可以用双蒸水

配制

2. 

配制?/p>

4

度保?/p>

 

不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑?/p>

lc3

的剪切,但能抑制后续的步

骤,

Chloroquine

抑制自噬体与溶酶体的融合过程?/p>

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不能完成,所?/p>

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才会累积?/p>

 

因此加了抑制?/p>

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之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中?/p>

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值,使溶酶体中的酸性水

解酶丧失活性,从而导致“自噬溶酶体”不能降解,因此,位于自噬体和自噬溶酶体膜上?/p>

LC3

不能按时降解,表现为

LC3

荧光长时间的保留?/p>

WB

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LC3

条带变粗?/p>

 

 

Z-VAD-FMK

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抑制

EV71

感染所引起的细胞凋亡,

观察细胞的自噬情况?/p>

研究发现,抑制细胞凋亡能增加

LC3-I

转化?/p>

LC3-II

以及

p62

的降解?/p>

 

 

1. 

 

 

雷帕霉素:作为以

mTOR 

为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用,推荐工作浓度?/p>

1

μ

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-

10

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2. 

 

 

氯喹:氯喹(

Chloroquine

)作为溶酶体的抑制剂,可以抑制自噬体与溶酶体的融合从

而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究,推荐使用浓度:

10umol

-

50umol

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因此,必须对自噬进行人工干预和调节,

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12 mg

粉末溶于

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使其浓度?/p>

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-

20

冰箱保存?/p>

 

临用前用

MEM

稀释到终浓?/p>

50 umol/L;

 

 

Rapamycin:

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培养基配成终浓度?/p>

1 umol/L,

现用现配

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400ng/ml

喹乙?/p>

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称取

4 mg

喹乙?/p>

,DMSO

预溶

(

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<0.1%)

后加?/p>

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溶解

,

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3

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10mmol/L;

 

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)可干扰或阻断自

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体的形成

 

 

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RAPAMYCIN

诱导自噬我也查过一部分文献,有用无血清的,也有用,一般培养基的,浓度

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25nM

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100nM

都有,用的是

50nM

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所诱导出来的自噬?/p>

 

 

文献说饥饿初期激活的是大分子自噬,在

4

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6

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24h

后以

CMA

途径为主

 

Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h

 

sigma

?/p>

EBSS

,货?/p>

E2888

,有碳酸氢钠,有酚红的,酚红到不是很必须,只是一?/p>

PH

指示

作用,好看些

 

无血清诱导自噬:

EBSS 

诱导

6

个小时就可以了?/p>

 

EBSS

一定可以诱导出来,

只是需要说明的是时间点的设置,

因为从饥饿诱导开始半个小时就?/p>

能开始自噬了,一直到

24

小时都持续,所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很

大的问题是,

饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡,

这也是我面临的问题,

就是在细胞收养的

时候蛋白浓度太小了?/p>

24

小时就很少了,更不要?/p>

48

小时?/p>

72

小时?/p>

 

Hank's

诱导?/p>

也就是通常所说的饥饿诱导?/p>

细胞培养到对数生长期后以

Hank's

替代常规完全?/p>

养基?/p>

3h

后就可诱导出自噬

?/p>

我用

Hank's

诱导?/p>

3h

后电镜观察有

30%

细胞都有自噬这种现象?/p>

但不如国外报道的高?/p>

 

 

sigma

的氯喹的货号

C6628

?/p>

用氯喹做自噬抑制剂,

293T

细胞

50uM

就可以?/p>

1. 

可以用双蒸水

配制

2. 

配制?/p>

4

度保?/p>

 

不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑?/p>

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的剪切,但能抑制后续的步

骤,

Chloroquine

抑制自噬体与溶酶体的融合过程?/p>

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不能完成,所?/p>

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才会累积?/p>

 

因此加了抑制?/p>

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之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中?/p>

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解酶丧失活性,从而导致“自噬溶酶体”不能降解,因此,位于自噬体和自噬溶酶体膜上?/p>

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抑制

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感染所引起的细胞凋亡,

观察细胞的自噬情况?/p>

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转化?/p>

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以及

p62

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1. 

 

 

雷帕霉素:作为以

mTOR 

为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用,推荐工作浓度?/p>

1

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10

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2. 

 

 

氯喹:氯喹(

Chloroquine

)作为溶酶体的抑制剂,可以抑制自噬体与溶酶体的融合从

而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究,推荐使用浓度:

10umol

-

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正常培养的细胞自噬活性很低,不适于观察?/p>

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自噬研究方法 - 百度文库
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12 mg

粉末溶于

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冰箱保存?/p>

 

临用前用

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稀释到终浓?/p>

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培养基配成终浓度?/p>

1 umol/L,

现用现配

;

 

400ng/ml

喹乙?/p>

:

称取

4 mg

喹乙?/p>

,DMSO

预溶

(

体积

<0.1%)

后加?/p>

10 ml MEM

培养液至完全

溶解

,

现用现配

,

避光保存

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3

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MA:

首先?/p>

PBS

溶解粉末

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临用前加热至完全溶解后再加入

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培养基至终浓?/p>

10mmol/L;

 

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体的形成

 

 

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都有,用的是

50nM

的雷帕霉素,加入一般的培养基中,目的是排除无血?/p>

所诱导出来的自噬?/p>

 

 

文献说饥饿初期激活的是大分子自噬,在

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-

6

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24h

后以

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指示

作用,好看些

 

无血清诱导自噬:

EBSS 

诱导

6

个小时就可以了?/p>

 

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一定可以诱导出来,

只是需要说明的是时间点的设置,

因为从饥饿诱导开始半个小时就?/p>

能开始自噬了,一直到

24

小时都持续,所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很

大的问题是,

饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡,

这也是我面临的问题,

就是在细胞收养的

时候蛋白浓度太小了?/p>

24

小时就很少了,更不要?/p>

48

小时?/p>

72

小时?/p>

 

Hank's

诱导?/p>

也就是通常所说的饥饿诱导?/p>

细胞培养到对数生长期后以

Hank's

替代常规完全?/p>

养基?/p>

3h

后就可诱导出自噬

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我用

Hank's

诱导?/p>

3h

后电镜观察有

30%

细胞都有自噬这种现象?/p>

但不如国外报道的高?/p>

 

 

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C6628

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用氯喹做自噬抑制剂,

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50uM

就可以?/p>

1. 

可以用双蒸水

配制

2. 

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度保?/p>

 

不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑?/p>

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的剪切,但能抑制后续的步

骤,

Chloroquine

抑制自噬体与溶酶体的融合过程?/p>

autophgy

不能完成,所?/p>

lc3

才会累积?/p>

 

因此加了抑制?/p>

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之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中?/p>

pH

值,使溶酶体中的酸性水

解酶丧失活性,从而导致“自噬溶酶体”不能降解,因此,位于自噬体和自噬溶酶体膜上?/p>

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不能按时降解,表现为

LC3

荧光长时间的保留?/p>

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抑制

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转化?/p>

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1. 

 

 

雷帕霉素:作为以

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为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用,推荐工作浓度?/p>

1

μ

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-

10

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2. 

 

 

氯喹:氯喹(

Chloroquine

)作为溶酶体的抑制剂,可以抑制自噬体与溶酶体的融合从

而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究,推荐使用浓度:

10umol

-

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