1
1
聚合酶链反应?/p>
polymerase chain reaction
?/p>
PCR
)的基本原理
PCR
反应过程与细胞内?/p>
DNA
复制相似?/p>
?/p>
PCR
的反应体系要简?/p>
的多,主要包?/p>
DNA
靶序列、引物?/p>
4
种单核苷?/p>
dNTP
、耐热
DNA
?/p>
合酶以及合适的缓冲液体系?/p>
PCR
反应过程有以?/p>
3
个步骤:①变性。将
反应体系混合物加热到
94
℃,维持较短时间(大?/p>
15 s-30 s
),使目?/p>
DNA
双螺旋的氢键断裂,形成单?/p>
DNA
作为反应模板?/p>
②退火。将?/p>
应体系冷却至特定的温度(引物?/p>
TM
值左右或以下),引物?/p>
DNA
?/p>
板的互补区结合,形成模板引物复合物?/p>
③延伸?/p>
将反应体系的温度提高
?/p>
72
℃并维持一段时间,引物在耐热聚合酶的作用下,以引物为固定?/p>
点,?/p>
4
种单核苷酸(
dNTP
)作为底物合成新?/p>
DNA
链。以上三步作?/p>
一个循环重复的进行,每一循环的产物作为下一循环的模板。如此循环数
十次,从而使目的基因得到指数级扩增,达到检测或获取基因的目的?/p>
2 PCR
仪的分类
根据
DNA
扩增的目的和检测的标准可以?/p>
PCR
仪分?/p>
普?/p>
PCR
仪,
梯度
PCR
仪,原位
PCR
,实时荧光定?/p>
PCR
?/p>
等几类?/p>
2.1
普?/p>
PCR
?/p>
一般把一?/p>
PCR
扩增只能运行一个特定退火温度的
PCR
仪,称之?/p>
普?/p>
PCR
仪?/p>
如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行?/p>
主要是用?/p>
简单的,对目的基因退火温度的扩增?/p>
主要应用于科研、教学、临床医学、检验、检疫等?/p>
2.2
梯度
PCR
?/p>
一次?/p>
PCR
扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(通常
12
种温
度梯度)的称之为梯度
PCR
仪。因为被扩增的不同的
DNA
片段其最适合
的退火温度不同,通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次?/p>
PCR
扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。主?/p>
用于研究未知
DNA
退火温度的扩增,这样既节约时间,也节约经费。在
不设置梯度的情况下亦可当做普通的
PCR
用?/p>
真正的梯度,
是每一排管?/p>
有精确的加热控温探头?/p>
2009
年为止只?/p>
美国
ABI
公司
可以做到。其?/p>
的都是从两头的热传递来设计控温?/p>