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Pichia
酵母表达系统使用心得
甲醇酵母表达系统有不少优点,
其中?/p>
Invitrogen
公司?/p>
Pichia
酵母表达系统最为人?/p>
知,
并广泛应用于外源蛋白的表达?/p>
虽然说酵母表达操作简单表达量高,
但是在实际操作中?/p>
并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的?/p>
不少人在操作中会遇到这样那样的问题,
收集
了部分用户在使用
EasySelect Pichia Expression System
这个被誉为最简单的毕赤酵母表达?/p>
经典试剂盒过程中的心得体会。其?/p>
Xiang
Yang
是来自美国乔治城大学?/p>
Georgetown
University
?/p>
Lombardi
癌症中心?/p>
Lombardi Cancer Center
?/p>
,部分用户来自国内?/p>
甲醇酵母部分优点?/p>
1.
属于真核表达系统,具有一定的蛋白质翻译后加工,有利于真核蛋白的表达;
2.AOX
强效启动子,外源基因产物表达量高,表达产物可以达到每升数克的水平?/p>
3.
酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物,远较真核?/p>
统简单,非常适合大规模工业化生产?/p>
4.
可以诱导表达,也可以分泌表达,便于产物纯化;
5.
可以甲醇代替
IPTG
作为诱导物,部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源,
生产成本低?/p>
产品性能:优?/p>
—?/p>
使用简单,表达量高?/p>
His-tag
便于纯化;缺?/p>
—?/p>
酵母表达蛋白有时
会出现蛋白切割问题?/p>
巴斯德毕赤酵母(
Pichia pastoris
)是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种,一方面由于
其是属于真核生物?/p>
因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰?/p>
另一方面毕赤酵母生长速度
快,可以将表达的蛋白分泌到培养基中,方便蛋白纯化?/p>
毕赤酵母表达载体
pPICZ
在多克隆位点?/p>
MCR
?/p>
3'
端带?/p>
his-tag
?/p>
c-myc epitopes
,这
?/p>
tag
有利于常规检测和纯化,而且?/p>
MCR5'
端引入了
alpha
factor
?/p>
α
-factor
)用以分泌表
达,并且在表达后
α
-factor
可以自动被切除。在进行克隆的时候,如果你选择的是
EcoRI
?/p>
那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另?/p>
pPICZ
系列选用的是
Zeocin
?/p>
生素作为筛选标记,
而诱导表达的载体需要甲?/p>
—?/p>
甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使?/p>
?/p>
IPTG
便宜?/p>
第一?/p>
—?/p>
构建载体
Xiang Yang
?/p>
pPICZ
系列有许多克隆位点可供选择,同时也有三种读码框以便不用的用户需
要?/p>
红叶山庄:有关是选择
pPIC9K
还是
pPICZ
系列?/p>
pPIC9K
属于穿梭质粒,也可以在原核表
达,?/p>
pPICZ
系列比较容易操作,大肠和毕赤酵母均用?/p>
Zeocin
筛选(
PIC9K
操作麻烦一
点,大肠?/p>
amp
抗性,而毕赤酵母先?/p>
His
缺陷筛选阳性克隆,在利?/p>
G418
筛选多拷贝?/p>
?/p>
而且对于大小合适(
30
?/p>
50KD
)的蛋白在产量上?/p>
pPIC9K
无法比拟的?/p>
leslie
:要做毕赤酵母表达实验,首先当然就要了解这个可爱的酵母了(椭圆形,肥嘟嘟的,
十分可爱?/p>
?/p>
她和大肠杆菌长得有较大区?/p>
(大肠杆菌是杆状的)
?/p>
因此在培养的过程中要?/p>
别这两种菌体,除了气味,浓度,颜色以外,也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达
的时候应该都遇过这种情况吧,
表达过程中染?/p>
(我们实验室曾经污染过各种颜色形状的?/p>
菌,那真是一段可怕的经历?/p>
,如果在不知情的情况下继续做下去,那可以就是浪费大把?