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1 

Pichia

酵母表达系统使用心得

 

甲醇酵母表达系统有不少优点,

其中?/p>

Invitrogen

公司?/p>

Pichia

酵母表达系统最为人?/p>

知,

并广泛应用于外源蛋白的表达?/p>

虽然说酵母表达操作简单表达量高,

但是在实际操作中?/p>

并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的?/p>

不少人在操作中会遇到这样那样的问题,

收集

了部分用户在使用

EasySelect Pichia Expression System

这个被誉为最简单的毕赤酵母表达?/p>

经典试剂盒过程中的心得体会。其?/p>

Xiang 

Yang

是来自美国乔治城大学?/p>

Georgetown 

University

?/p>

Lombardi

癌症中心?/p>

Lombardi Cancer Center

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,部分用户来自国内?/p>

 

甲醇酵母部分优点?/p>

 

1.

属于真核表达系统,具有一定的蛋白质翻译后加工,有利于真核蛋白的表达;

 

2.AOX

强效启动子,外源基因产物表达量高,表达产物可以达到每升数克的水平?/p>

 

3.

酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物,远较真核?/p>

 

统简单,非常适合大规模工业化生产?/p>

 

4.

可以诱导表达,也可以分泌表达,便于产物纯化;

 

5.

可以甲醇代替

IPTG

作为诱导物,部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源,

生产成本低?/p>

 

产品性能:优?/p>

—?/p>

使用简单,表达量高?/p>

His-tag

便于纯化;缺?/p>

—?/p>

酵母表达蛋白有时

会出现蛋白切割问题?/p>

 

 

 

 

 

巴斯德毕赤酵母(

Pichia pastoris

)是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种,一方面由于

其是属于真核生物?/p>

因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰?/p>

另一方面毕赤酵母生长速度

快,可以将表达的蛋白分泌到培养基中,方便蛋白纯化?/p>

 

 

毕赤酵母表达载体

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在多克隆位点?/p>

MCR

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,这

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有利于常规检测和纯化,而且?/p>

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)用以分泌表

达,并且在表达后

α

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可以自动被切除。在进行克隆的时候,如果你选择的是

EcoRI

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那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另?/p>

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系列选用的是

Zeocin

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生素作为筛选标记,

而诱导表达的载体需要甲?/p>

—?/p>

甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使?/p>

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IPTG

便宜?/p>

 

第一?/p>

—?/p>

构建载体

 

 

Xiang Yang

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系列有许多克隆位点可供选择,同时也有三种读码框以便不用的用户需

要?/p>

 

 

红叶山庄:有关是选择

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还是

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系列?/p>

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属于穿梭质粒,也可以在原核表

达,?/p>

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系列比较容易操作,大肠和毕赤酵母均用?/p>

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操作麻烦一

点,大肠?/p>

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抗性,而毕赤酵母先?/p>

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缺陷筛选阳性克隆,在利?/p>

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筛选多拷贝?/p>

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而且对于大小合适(

30

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)的蛋白在产量上?/p>

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无法比拟的?/p>

 

 

leslie

:要做毕赤酵母表达实验,首先当然就要了解这个可爱的酵母了(椭圆形,肥嘟嘟的,

十分可爱?/p>

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她和大肠杆菌长得有较大区?/p>

(大肠杆菌是杆状的)

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因此在培养的过程中要?/p>

别这两种菌体,除了气味,浓度,颜色以外,也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达

的时候应该都遇过这种情况吧,

表达过程中染?/p>

(我们实验室曾经污染过各种颜色形状的?/p>

菌,那真是一段可怕的经历?/p>

,如果在不知情的情况下继续做下去,那可以就是浪费大把?

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Pichia

酵母表达系统使用心得

 

甲醇酵母表达系统有不少优点,

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虽然说酵母表达操作简单表达量高,

但是在实际操作中?/p>

并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的?/p>

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3.

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5.

可以甲醇代替

IPTG

作为诱导物,部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源,

生产成本低?/p>

 

产品性能:优?/p>

—?/p>

使用简单,表达量高?/p>

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便于纯化;缺?/p>

—?/p>

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会出现蛋白切割问题?/p>

 

 

 

 

 

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因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰?/p>

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快,可以将表达的蛋白分泌到培养基中,方便蛋白纯化?/p>

 

 

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可以自动被切除。在进行克隆的时候,如果你选择的是

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而且对于大小合适(

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十分可爱?/p>

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的时候应该都遇过这种情况吧,

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5.

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生产成本低?/p>

 

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毕赤酵母表达载体

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酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物,远较真核?/p>

 

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可以诱导表达,也可以分泌表达,便于产物纯化;

 

5.

可以甲醇代替

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作为诱导物,部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源,

生产成本低?/p>

 

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巴斯德毕赤酵母(

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