1
?/p>
试述利用基因工程的技术调控基因表达的主要方法
?/p>
1
?/p>
、基因表达系列分析技?/p>
基因表达系列分析技术是一种以测序为基础定量分析全基因组表达模式的技术,
能够直接?/p>
出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息。其基本原理是根据理论上任何长度超过
9-10
个碱基的核苷酸片段可代表一种转录产物的特意序列?/p>
因此?/p>
选择特定的限制性内切酶分离
转录产物中这些代表基因特异性的
9-10
各碱基的核苷酸序列并制成标签连接、克隆测序,
根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率?/p>
?/p>
2
?/p>
?/p>
RNA
选择性剪切机?/p>
RNA
的选择性剪切是指用不同的剪切方?/p>
(
选择不同的剪切位点组?/p>
)
从一?/p>
mRNA
前体产生
不同?/p>
mRNA
剪切异构体的过程?/p>
一般将选择性剪切分为如下几类:
平衡剪切?/p>
5
’选择性剪
切?/p>
3
’选择性剪切,外显子遗漏,相互排斥性剪切。可?/p>
RT-PCR
的方法研究一个基因是?/p>
存在选择性剪切。其步骤是:首先?/p>
cRNA
两端特异性引物或来自不同外显子的引物序列?/p>
不同组织来源?/p>
RNA
样品中进行扩增,
观察
PCR
产物大小是否存在差异?/p>
如果发现差异?/p>
?/p>
序后可以分析出这种差异是否来自于选择性剪切?/p>
选择性剪切使一个基因翻译为多种蛋白?/p>
序列,是基因表达多样性的重要表现形式?/p>
?/p>
3
?/p>
、原位杂交技?/p>
原位杂交
(in situ hybridization,ISH)
是用标记的核酸探针,经放射自显影或非放射检?/p>
体系?/p>
在组织?/p>
细胞?/p>
间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。通常
可以分为
RNA
原位杂交和染色体原位杂交两大类:
1
?/p>
RNA
原位杂交用放射性或非放射?/p>
(
?/p>
地高辛、生物素?/p>
)
标记的特异性探针与被固定的组织切片反应,若细胞中存在与探针互补
?/p>
mRNA
分子,两者杂交产生双?/p>
RNA
,就可以通过检测放射性标记或经酶促免疫显色,?/p>
该基因的表达产物在细胞水平上作出定性定量分析;
2
?/p>
荧光原位杂交
(fluorescence
in
situ
hybridization,FISH)
技术首先对于寡核苷酸探针做特殊修饰和标记,然后用原位杂交法?/p>
靶染色体?/p>
DNA
上特定的序列结合?/p>
再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体来确定?/p>
DNA
序列在染色体的位置?/p>
FISH
技术不需要放射性同位素,实验周期短,检测灵敏度高?/p>
?/p>
4
)定点突变技?/p>
定点突变是重?/p>
DNA
进化的基础?/p>
该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码?/p>
氨基酸序列,
常用于研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构?/p>
催化活性以及结合配体能力的?/p>
响,也可用于改?/p>
DNA
调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等?/p>
但目前为
止选择氨基酸突变的位点存在一定的盲目性?/p>
主要是采用两?/p>
PCR
方法来实现:
重叠延伸技
术和大引物诱变法在基因序列中进行定点突变?/p>
?/p>
5
?/p>
RNAi
技?/p>
RNA
干扰
(RNA
interference,RNAi)
技术利用双链小
RNA
高效?/p>
特异性降解细胞内同源
mRNA
?/p>
从而阻断体内靶基因表达?/p>
使细胞出现靶基因缺失的表型?/p>
其过程一般为?/p>
?/p>
Dicer
的参?/p>
下,细胞中的双链
RNA
首先被降解形?/p>
21-25
个核苷酸的小片段双链
RNA(siRNA)
,然后又
siRNA
中的反义链指导合成一种被称为
RNA
诱导的沉默复合体
(RISC)
的核蛋白体,
再又
RISC
介导切割目的
mRNA
分子中与
siRNA
反义链互补的区域,从而实现干扰基因表达的功能。同
时,
siRNA
可作为特殊引物,在依赖于
RNA
?/p>
RNA
聚合酶的作用下,以目?/p>
mRNA
为模板合
?/p>
dsRNA
,后者又可被降解为新?/p>
siRNA
,重新进入上述循环?/p>
(6)
一些基本分子生物学手段
在启动子上游构建增强子、细菌培养时加入诱导物诱导产物生成等?/p>
2
、论述原核生物和真核生物基因组的异同
1
原核生物的基因组结构特点
1.1
染色体数量少,一般只有一条染色体
,
即一个核苷酸分子
,
无细胞核·