感受态细胞制?/p>
制备感受态常用的方法是电击法?/p>
CaCl
2
制备法,以下介绍
CaCl
2
制备法:
1
、可以从
-80
℃冰柜中?/p>
取出一支冻存菌株,
于事先照过紫外的超净台中?/p>
用无菌的接种?/p>
轻轻蘸取菌种后,
在无抗平?/p>
?/p>
由于
Rocetta
含有氯霉素抗性,
需要涂布在氯霉素抗性的?/p>
板,后面的都是如?/p>
)上划线,并将菌种迅速放?/p>
-80
℃保存,在划线板上做好相应标记,
?/p>
37
℃培养过夜?/p>
2
、从
37
℃培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于
2mlEP
管中?/p>
37
℃,
220rpm
震荡培养?/p>
6
个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以
1:100
的比例接种于
50ml
LB
液体
培养基(
2
瓶)?/p>
,37
℃振荡培?/p>
2.5
小时?/p>
OD600=0.5
?/p>
注意:接种比例不得大?/p>
1:10
?/p>
3
?/p>
在无菌条件下将细菌转移到一个无菌?/p>
预冷的离心管
?/p>
50ml
?/p>
中,
在冰上放?/p>
5~10min
?/p>
注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管,划板、接种、转?/p>
均要严格按照无菌操作?/p>
4
?/p>
4
?/p>
5000g
离心
5
分钟。用预冷的去离子水洗涤沉淀?/p>
4
?/p>
5000g
离心
5
分钟?/p>
Note
:此步主要是为了洗去培养基中的盐?/p>
5
?/p>
沉淀加入
2ml
预冷?/p>
0.05mol/L CaCl
2
-15%
甘油混合溶液?/p>
轻吹散,
冰浴
5
分钟?/p>
4
?/p>
5000g
离心
5
分钟?/p>
6
、沉淀加入
2ml
预冷?/p>
0.05mol/L CaCl
2
-15%
甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细?/p>
悬液。分装成
50~100
μ
l
的小份,贮存?/p>
-70
℃可保存半年?/p>
?/p>
15%
甘油?/p>
0.05mol/L CaCl
2
制备方法
:
称取
0.28g
CaCl
2
(
无水
,
分析?/p>
),
溶于
50ml
重蒸水中
,
加入
15ml
甘油
,
定容?/p>
100ml,
高压?/p>
菌?/p>
感受态细胞的特征
感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外?/p>
DNA
的状态。感受态细胞的特征?/p>
?/p>
1
)细胞表面暴露出一些可接受外来
DNA
的位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞的接
受位点充分暴露)
?/p>
?/p>
2
)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,?/p>
DNA
直接穿过质膜进入细胞?/p>
?/p>
?/p>
3
)受体细胞的修饰酶活性最高,而限制酶活性最低,使转入的
DNA
分子不易被切除或破坏?/p>