1
实验?/p>
人类染色体标本制备及核型分析
一?/p>
目的
1
?/p>
了解人类外周血淋巴细胞染色体玻片标本制备方法?/p>
2
?/p>
观察正常人体细胞染色体的形态、数目,掌握核型分析方法?/p>
二?/p>
试剂与器?/p>
1
?/p>
RPMI-1640
培养基?/p>
小牛血清?/p>
PHA
?/p>
5mg/ml
?/p>
?/p>
秋水仙素
?/p>
10
μ
g/ml
?/p>
?/p>
肝素
?/p>
600
IU/ml
?/p>
?/p>
固定液(甲醇:冰醋酸?/p>
3
?/p>
1
?/p>
、低渗液?/p>
0.075mol/L
氯化钾)
?/p>
5%NaHCO
3
溶液、三蒸水?/p>
双抗
(
青、链霉素
)
?/p>
Giemsa
染液?/p>
1%
?/p>
?/p>
PH6.8
磷酸缓冲液?/p>
2
?/p>
超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、鼓风干燥机、离心机、冰箱、高压消毒锅?/p>
分析天平、注射器、培养瓶、离心管、滴管、滤器、滤膜、酒精灯、载玻片?/p>
3
?/p>
显微镜、人类染色体玻片标本、拭镜纸、二甲苯、香柏油、人类染色体放大照片、核
型纸、剪刀?/p>
三?/p>
内容
1
?/p>
观看电教:人体外周血培养及染色体标本的制备?/p>
2
?/p>
人体外周血淋巴细胞的培养及染色体玻片标本制作?/p>
3
?/p>
正常人体细胞染色体核型分析?/p>
人类染色标本的制?/p>
(
一
)
实验原理
人体外周血淋巴细胞是保持了增殖潜能的暂不增殖细胞(
G
0
细胞?/p>
,一般可在血液中?/p>
环几年都不分裂。但在人工离体培养条件下,若在培养基中加?/p>
PHA
?/p>
phytohemagglutinin
?/p>
植物血细胞凝集素)
?/p>
PHA
可刺激
G
0
细胞转化为淋巴母细胞,重新获得增殖能力,并进行有
丝分裂。然后在培养基中加入适量秋水仙素?/p>
colchicne
?/p>
,使分裂细胞停滞于中期。用低渗
溶液处理?/p>
使分裂细胞膨胀。细胞悬液滴片后,通过加热使已膨胀的细胞爆裂,将染色体?/p>
散开来。最后用
Giemsa
染色,即可获得中期染色体标本?/p>
(
?/p>
)
操作步骤
1
?/p>
培养液配?/p>
RPMI-1640
粉剂
10.4g
,碳酸氢?/p>
2.0g
,溶?/p>
1000ml
三蒸水中,过滤除
菌?/p>
2
?/p>
在无菌条件下,用量筒?/p>
RPMI-1640
80ml
灭活胎牛血?/p>
20ml
青霉?/p>
100U/ml
链霉?/p>
100U/ml
将上述溶液混匀,用
5%
灭菌碳酸氢钠?/p>
1mol/L
HCl
,调整培养液
PH
?/p>
7.2-7.4
,分?/p>
培养瓶,每瓶
5ml
,使用前,每瓶临时加
1%PHA0.5-2ml
,用注射?/p>
5
号针头滴?/p>
500
μ
g/ml
肝素,摇匀?/p>
3.
培养
(1)
采血和培?/p>
用灭菌注射器抽取
600
μ
g/ml
的肝?/p>
0.2ml
,润湿针筒,然后将多余的
肝素弃去。常规消毒被检者的肘部皮肤,从肘部静脉采血
1ml
,分装于培养液的培养瓶中?/p>
每瓶装入全血
10
?/p>
(7
号针?/p>
)
,摇匀,静置于
37
℃恒温培养箱中,培养
68 -72
小时?/p>