MTT
原理、步骤、结果分析方法及注意事项
一?/p>
MTT
原理
MTT
全称?/p>
3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-2)-3,5-diphenytetrazoliumromide
?/p>
汉语
化学名为
3-(4
?/p>
5-
二甲基噻?/p>
-2)-2
?/p>
5-
二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。是
一种黄颜色的染料?/p>
MTT
比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检?/p>
原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源?/p>
MTT
还原为水不溶性的蓝紫
色结晶甲瓒(
Formazan
)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜
?/p>
DMSO
)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪?/p>
490 nm
波长处测定其?/p>
吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,
MTT
结晶形成的量?/p>
细胞数成正比?/p>
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测?/p>
大规模的抗肿
瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高?/p>
经济。缺点:由于
MTT
经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,须被溶解后才能检
测?/p>
这不仅使工作量增加,
也会对实验结果的准确性产生影响,
而且溶解甲的?/p>
机溶剂对实验者也有损害?/p>
二?/p>
MTT
溶液的配制方?/p>
通常,此法中?/p>
MTT
浓度?/p>
5 mg/mL
。因此,可以称取
MTT 0.5 g
,溶?/p>
100 mL
的磷酸缓冲液?/p>
PBS
?/p>
或无酚红的培养基中,?/p>
0.22
μm
滤膜过滤以除?/p>
溶液里的细菌,放
4
℃避光保存即可。在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔
纸包住?/p>
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,
觉得这样比较好?/p>
需
要注意的是,
MTT
法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝
对数。在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,
MTT
吸光度最
好在
0-0.7
范围内?/p>
MTT
一般最好现用现配,过滤?/p>
4º
C
避光保存两周内有效,或配制成
5
mg/mL
保存?/p>
-20º
C
长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或?/p>
黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都?/p>
MTT
粉分装在
EP
管里,用的时
候现配,直接往细胞培养板中加,没必要一下子配置那么多液体,尤其?/p>
MTT
变为灰绿色时就绝对不能再用了?/p>