第二次分子生物学实验报告
DNA
的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
一?/p>
实验目的
1
?/p>
学习和掌握限制性内切酶的分类?/p>
特性与作用原理?/p>
掌握载体和外源目?/p>
DNA
?
切的操作技术?/p>
2
?/p>
学习利用
T4 DNA
连接酶把酶切后的载体片段和外源目?/p>
DNA
片段连接起来,构
建体外重?/p>
DNA
分子的技术,了解并掌握几种常用的连接方法?/p>
3
?/p>
掌握利用
CaCl2
制备感受态细胞的方法?/p>
学习和掌握热击法转化
E. coli
的原理与
方法?/p>
4
?/p>
学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法?/p>
5
?/p>
学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法;
6
?/p>
复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法;
7
?/p>
通过对重组子进行重组质粒
DNA
的抽提与酶切鉴定,进一步确定重组质粒中?
有外源目?/p>
DNA
片段,并验证重组子是期望的重组子?/p>
二?/p>
实验原理
1
、限制性内切酶
限制性核酸内切酶是一类能够识别双?/p>
DNA
分子中的某种特定核苷酸序列,并由
此切?/p>
DNA
双链结构的酶,主要是从原核生物中分离纯化出来的。在限制性核酸内?/p>
限制酶的作用下,侵入细菌的“外源?/p>
DNA
分子便会被切割成不同大小的片段,而细
菌自己固有的
DNA
由于修饰?/p>
(
通常是一种甲基化?/p>
)
的保护作用,
则可免受限制酶的?/p>
解?/p>
目前已经鉴定?/p>
3
种不同类型的限制性核酸内切酶?/p>
即Ⅰ型酶?/p>
II
型酶?/p>
III
型酶?/p>
Ⅰ型酶切割位点是随机的,至少距识别位?/p>
1000bp
。Ⅲ型限制酶的切割位点距?/p>
别序?/p>
3'
端为
24
?/p>
26bp
。Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近,而且
具有序列特异性,故在基因克隆中有特别广泛的用途?/p>
Ⅱ型核酸内切限制酶具?/p>
3
个基本的特性:①在
DNA
分子双链的特异性识别序?/p>
部位切割
DNA
分子,产生链的断裂;?/p>
2
个单链断裂部位在
DNA
分子上的分布通常?/p>
是彼此直接相对的;③断裂结果形成?/p>
DNA
片段往往具有互补的单链延伸末端?/p>