模块?/p>
蛋白质之间的相互作用
1.
实验目的
本实验以重组质粒和酵母细胞为材料
,
学习检测蛋白质相互作用的基本原理和
技术方法?/p>
主要?/p>
绍酵母双杂交的基本原理与操作技?/p>
;
让学生了解和掌握酵母
双杂交系统的应用
;
掌握酵母感受态的
制备的基本原理和主要的操作步骤?/p>
2.
实验原理
1989
?/p>
Fields
?/p>
Song
等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识
(
即细胞内基因?/p>
录的起始需要转录激活因子的参与
,
提出并建立了酵母双杂交系
统。该系统作为发现和研究活细胞
体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技?/p>
平台
,
近几年得到了广泛的运用和发展?/p>
相比于其它蛋白质筛选系?/p>
,
酵母双杂交系统具有以下优?/p>
:(1
检测在真核活细
胞内进行
,
?/p>
一定程度上代表细胞内的真实情况?/p>
(2
作用信号是在融合基因表达?/p>
,
在细胞内重建转录因子的作
用而给出的
,
省去了纯化蛋白质的繁琐步骤?/p>
(3
检测结
果是基因表达产物的积累效?/p>
,
因而可检?/p>
存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相?/p>
作用?/p>
(4
酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类?/p>
和分化时期材料构?/p>
cDNA
文库
,
能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功
能蛋
白?/p>
(5
通过
mRNA
产生多种稳定的酶使信号放大。同?/p>
,
酵母表型?/p>
X-Gal
?/p>
HIS3
蛋白?/p>
达等检测方法均很敏感?/p>
酵母双杂交系统也具有一定的局限性?/p>
首先
,
经典的双杂交系统分析蛋白间的
相互作用定位于细
胞核?/p>
,
因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋?/p>
的研究?/p>
酵母双杂交系统的另一个局
限性是
?/p>
假阳?/p>
?nbsp;
。在酵母双杂交系统建立的
初期阶段
,
由于仅仅采用
β
-
半乳糖苷酶这一单一的报?/p>
基因体系
,
这种报告基因的表
达往往不能十分严谨地被控制
,
因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本
身具有激?/p>
转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作?/p>
,
?/p>
DNA
结合结构域融合蛋白在
无特?/p>
激活结构域的情况下也可被激活转录?/p>
另外某些蛋白表面含有对多种蛋?