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1
?/p>
?/p>
3
?/p>
离子交换柱层析分离与纯化凝集?/p>
一、实验目?/p>
本实验以红花石蒜为材料,
将其粗提液进行硫酸铵沉淀后,
再用离子交换柱层析进行分
离?/p>
本实验的目的是:
了解离子交换层析技术的原理?/p>
掌握用离子交换层析技术分离蛋白质
的基本技术?/p>
二、实验原?/p>
离子交换层析分离蛋白质的过程
,
主要是利用蛋白质具有不同的电荷而进行分离?/p>
依靠?/p>
加缓冲液中的离子强度或改?/p>
pH
值使蛋白质带不同种类和数目的电荷?/p>
改变蛋白质与离子?/p>
换剂的结合状?/p>
,
从而使不同的蛋白质得以分离。要成功地分离某种混合物,必须根据其所
含物质的解离性质?/p>
带电状态选择适当类型的离子交换剂?/p>
并控制吸附和洗脱条件
(主要是
洗脱液的离子强度?/p>
pH
值)
,使混合物中各组分按亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱?/p>
来?/p>
离子交换剂是连接有离子基团的不溶性惰性颗粒,可由多种材料制成
,
如纤维素
,
葡聚?/p>
凝胶
,
琼脂糖凝胶和合成树脂。常用于蛋白质分离纯化的离子交换剂为离子交换纤维?/p>
,
离子
交换葡聚糖凝胶和离子交换琼脂糖凝胶。带正电荷的离子交换剂可以靠静电结合阴离子,?/p>
为阴离子交换剂。带负电荷的离子交换剂称为阳离子交换剂。离子交换剂根据带电基团解离
程度的不?/p>
,
又有强弱之分。强离子交换剂的带电基团在所?/p>
pH
范围内解离;弱离子交换剂
的带电基团的解离状态则取决?/p>
pH
,只在一?/p>
pH
范围内解离?/p>
本实验采用的凝胶柱为
DEAE-Sephrose
阴离子交换琼脂糖凝胶柱?/p>
三、试剂与器材
主要试剂?/p>
弱碱型阴离子交换琼脂糖凝胶:
DEAE-Sephrose
?/p>
NaOH
?/p>
NaCl
?/p>
Tris
?/p>
盐酸?/p>
乙醇?/p>
主要溶液?/p>
生理盐水?/p>
0.5M NaOH
溶液?/p>
0.05M,
pH7.6
Tris-HCl
缓冲液?/p>
0.05M,
pH7.6
?/p>
1M
NaCl
?/p>
Tris-HCl
缓冲?/p>
主要器材?/p>
离子交换层析柱、储液瓶、梯度洗脱仪、紫外检测仪和记录仪、部分收集器?/p>
pH
计?/p>
恒流泵、透析?/p>
四、试剂配?/p>
1
.配?/p>
1L
?/p>
0.5M
?/p>
pH7.6
?/p>
Tris-HCl
母液
?/p>
M
r
=121.14
?/p>
称量
60.57g
Tris
,加?/p>
400ml
蒸馏水将粉末溶解后,加入适量盐酸?/p>
pH
值至
7.6
,最后定
容至
1L