实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备
【课前预习】
1、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理是什么？ 2、大肠杆菌感受态细胞的制备可以采用哪些方法？
【目的要求】
1、了解感受态细胞生理特性及制备条件； 2、掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法；
【基本原理】
所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖， 重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而在选择性培养基平板中，可以选出阳性细菌转化子。Ca2+处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA 愈小，转化率愈高。环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。CaCl2转化法的优点是：简单快速，重复性好，菌株适用范围广。
另外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部，转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效
期6个月）。
【实验用品】
（一）仪器与器皿
恒温振荡器、分光光度计、电动沉淀离心机、旋涡混合器、恒温培养箱隔、电热恒温、水浴锅、恒温摇床、普通冰箱、Eppendorf管、转液管、平皿、涂布棒、微量取样器、微波炉、三角烧瓶、试管、刻度离心管、保温瓶、酒精灯等。 （二）菌种
大肠杆菌DH5α（rk- mk- rec-） （三）培养基与试剂
1、LB 液体培养基（1%蛋白胨、0.5%酵母粉和0.5%NaCl，pH7.5。） 2、100 mmol/ L CaCl2溶液
3、氨苄青霉素溶液（50 毫克/毫升）
4、CaCl2-MgCl2（80mmol/l MgCl2，20mmo/l CaCl2)溶液配制：
储存液配制：5M CaCl2配制：CaCl2·2H2O 36.75g→50mL H2O，37℃孵箱中放置过夜使之完全溶解，用除菌滤器过滤除菌；
2M MgCl2配制：MgCl2·6 H2O 20.3g→50mL H2O，高压灭菌。工作液配制： 0.1M CaCl2-MgCl2配制： 10ml: 5M CaCl2 40ul +2M MgCl2 400ul + H2O 9.56ml
【方法步骤】
（一）大肠杆菌感受态细胞制备
1、将大肠杆菌DH5α接种于LB平板上活化，置于恒温培养箱中37℃培养过夜。 2、挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落接种于一只装有5毫升LB液体培养基的灭菌试管中，于37°C下振荡培养过夜。
3、 转移0.5毫升过夜培养物于一只装有50毫升LB培养基（接种量按菌液浓度而定，一般在1%左右）的灭菌三角瓶中，37°C下振荡培养2到2.5小时（此时细菌处于对数生长期）。 4、取1 毫升培养液以未接种的LB 作空白对照，在分光光度计上测OD600 的光密度值，约为0.2-0.5 左右。
5、 无菌条件下将上述1 毫升菌液倒入1.5毫升EP 离心管中（离心管应带盖并高压灭菌过），每组2 支。室温下，4000 rpm离心5分钟收集对数期细胞， 弃培养基，保留细胞沉淀。 6、加入预冷的100mmol/L CaCl2-MgCl2溶液(80mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2) 600微升，用微量取样器轻轻吸冲底部沉淀菌体，使其悬浮后，把2支管转为1支，摇匀后于冰浴中放置30分钟。
7、 4°C下，4000 rpm离心10分钟收集细胞； 弃MgCl2-CaCl2 溶液，保留细胞沉淀。 8、再把菌体悬浮在200 微升100mmol/L CaCl2 的溶液中，并轻微打匀，冰浴放置2小时。
此时，可以将制备的细胞直接转化，也可以将细胞放置在4℃冰箱中，于1-7d内使用；也可以向细胞液中加入甘油，至甘油终浓度为10%，-70℃长期保存。
注：自己制备的感受态细胞用作下次质粒转化实验中。
【注意事项】
1、细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好。
2、试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2-和MgCl2等均需是最高纯度的，并用超纯水配制。 3、防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所有器皿和试剂都要高温灭菌。
【实验结果】
将自己制作的感受态细胞拍照记录； 比较对照平皿和转化平皿，计算转化率；
【实验讨论】
感受态细胞制备时为什么要控制大肠杆菌的细胞生长期？