免疫组化基本步骤

细胞免疫组化染色步骤

1.细胞爬片,取出后,PBS洗三遍,每次3分钟。4℃冷丙酮固定10分钟,(或用4%多聚甲醛固定30分钟),干燥30分钟。

2. 用PBS洗三次,每次5分钟,加3%过氧化氢30μl,室温孵育10分钟,(以消除内源性过氧化物酶的活性)蒸馏水冲洗,PBS洗三次,每次5分钟。

3.加1%的Triton X-100 30μl,室温孵育10分钟,增加细胞膜的通透性。蒸馏水冲洗,PBS洗三次,每次5分钟。

4.滴加正常山羊血清30μl,封闭非特异性结合位点,以消除非特异性染色,室温孵育30分钟,倾去勿洗。

5.滴加适当稀释度的一抗,空白对照组以PBS代替一抗,4℃湿盒孵育过夜。PBS洗三次,每次5分钟。

6.滴加生物素标记的二抗工作液30μl,室温孵育30分钟。PBS洗三次,每次5分钟。

7.滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl,室温孵育30分钟。PBS洗三次,每次5分钟。

8.滴加DAB显色剂30μl,显微镜下观察显色,自来水冲洗。

9. 将处理好的玻片细胞核衬染:浸入苏木精染液染色2min,自来水洗,迅速过盐酸酒精溶液,自来水洗,过氨水溶液,自来水洗。

10.梯度酒精脱水,过70%酒精1次,95%酒精2次,无水乙醇3次,每次1min

11.二甲苯透明,过二甲苯溶液3次,每次1min。 12.中性树胶封片将有细胞的一面向下,用中性树脂封片。

稀盐酸酒精溶液:用75%酒精配制1%盐酸。

淡氨水溶液:在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化)

另外:需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索,我是染5-6秒脱色1-2秒。 盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。 我没用淡氨水溶液。若为悬浮细胞则需涂片,20μl即可。

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