产淀粉酶芽孢杆菌的分离与初步鉴定
吴月婷
摘要：从土壤中分离得到一株产淀粉酶的芽孢杆菌X-1，对其进行形态学鉴定和生理生化特性分析，包括菌落形态、菌体形态、糖利用情况、生长pH范围、耐盐范围、明胶液化和酪素的水解等，初步鉴定为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或地衣芽孢杆菌（Bacillus lentus）。 关键词：产淀粉酶；芽孢杆菌；分离；初步鉴定
淀粉酶(Amylase)是指能分解淀粉糖苷键的一类酶，主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶等，在生物体的糖类代谢中起重要的作用。其中α-淀粉酶（1,4-α-D-glucan glucanohydrolase）能水解淀粉大分子的α-1,4-糖苷键，生成糊精、麦芽寡糖、麦芽糖、葡萄糖等水解产物[1]。α-淀粉酶在植物、动物和微生物中都广泛存在，常见的产淀粉酶微生物有芽孢杆菌、放线菌、黑曲霉、米曲霉、红曲霉和根霉等[2-7]。 芽孢杆菌属(Bacillus)是一类能产生芽孢的革兰氏阳性细菌，具有较强的抵抗不良环境的能力，如耐酸碱、耐高温的能力较强。芽孢杆菌中较多菌种具有高淀粉酶、蛋白酶活性，近年来被广泛地用于动物饲料业，特别是作为水产饲料的添加剂。例如在银鲫饲料中添加了0.1%的芽孢杆菌后，银鲫肠道和肝胰脏的淀粉酶活性提高了3.7%和129.5%[8]，能够有效帮助动物对饲料的消化吸收，同时作为一种良好的免疫激活剂，能增强动物的免疫力和抗病力[9]。此外，利用芽孢杆菌产生α-淀粉酶，在食品生产中也有广泛应用。
笔者从土壤中分离得到产淀粉酶的芽孢杆菌，
进行种属的初步鉴定，以期为芽孢杆菌在动物饲料
业和食品生产中的发开应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
土壤材料采集于浙江师范大学取杏园食堂草坪土壤表层5~10厘米下的肥土。 1.2 培养基
淀粉培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨l%、葡萄糖0.5%、Nacl 0.5%、牛肉膏0.5%、琼脂粉0.8%。生理生化鉴定培养基见文献[10]。 1.3 方法
1.3.1 样品的采集收集校园食堂草坪处的土壤1份作为试验样品。
1.3.2 产淀粉酶芽孢杆菌的分离取1 g土壤样品加入10 mL无菌水混合， 80℃水浴加热10 min，取上清液1 mL进行梯度稀释，得到一系列不同浓度的稀释菌液。涂布于淀粉培养基上，37℃培养24 h后挑取不同形态的单菌落转接至新淀粉培养基，37℃培养48ｈ。用卢戈氏碘液进行染色，菌落周围有透明圈的表明有淀粉酶产生。测量透明圈直径T和菌落直径C，T/C越大表明淀粉酶活性越高[11]，选出淀粉酶活性较高的菌种，在另一不加碘液的培养基选择
该菌种接种至试管斜面，于４℃保藏。 1.3.3形态学鉴定活化后的菌株用接种针点接于淀粉培养基上，37℃培养24 h后观察菌落形态。同时进行革兰氏染色、鞭毛染色，在光学显微镜下观察菌体形态。革兰氏染色、鞭毛染色方法参照文献[10]。1.3.4 生理生化鉴定包括菌株的乳糖发酵、pH范围、耐盐试验、厌氧试验、明胶液化、柠檬酸盐利用、酪素水解、吲哚反应、V-P试验、甲基红试验，方法参照文献[10]。 2 结果与分析 2.1产淀粉酶芽孢杆菌的分离
在土壤样品中初步筛选得到3株有产生淀粉酶
能力的菌株，其中X-1的淀粉酶活性较高，平均T/C
值达到3.32，选取该菌株进行菌种鉴定。
X-3
X-1
X-2
图1产淀粉酶初选结果图2 X-1革兰氏染色结果
2.2 形态学鉴定
2.2.1 菌落形态 X-1菌株的菌落形态如图1所示，菌落扁平，圆形或近圆形，边缘不整齐，乳白色，
不透明，不易挑取，表面粗糙、裂片状，中间略下凹，产生红色色素。
2.2.2 菌体形态 X-1菌株经革兰氏染色后在光学显微镜下观察(图2)，无明显线状排列，单个菌呈杆状，大小（0.6~0.8）μm×（2~3.5）μm，呈革兰氏阳
项目 淀粉水解试验 葡萄糖利用试验 葡萄糖产气试验 明胶液化试验 酪素水解试验 柠檬酸盐试验 V-P试验 吲哚试验 甲基红试验 厌氧试验 2.5%NaCl耐盐试验 5%NaCl耐盐试验 10%NaCl耐盐试验 pH 3.0生长试验 pH 5.0生长试验 pH 7.0生长试验 pH 9.0生长试验
注：“+”代表阳性反应，“-”代表阴性反应。
试验现象 碘液染色后有透明圈 溶液部分变黄 不产生气体 37℃下明胶液化 牛奶石蕊上层变为无色 培养基没有变蓝 加入指示剂后变红
性，芽孢中生，无明显膨大。鞭毛染色结果显示该菌株长有侧生鞭毛和纤毛。 2.3 生理生化鉴定
X-1菌株的生理生化试验结果如表1所示。
表1 X-1菌株的生理生化特征
现象分析
试验菌株能产生淀粉酶，水解淀粉
能利用葡萄糖产酸 利用葡萄糖发酵不产气 试验菌株能产生明胶酶，液化明胶 试验菌株能产生酪素酶，水解酪素 试验菌株不能利用柠檬酸盐 试验菌株能产生乙酰甲基甲醇 试验菌株能产色氨酸酶，产生吲哚 试验菌株能利用葡萄糖产酸
试验菌株好氧
试验菌株能在2.5%盐浓度下生长 试验菌株能在5%盐浓度下生长 试验菌株不能在7%盐浓度下生长 试验菌株在pH 3.0的环境不生长 试验菌株能在pH 5.0的环境下生长 试验菌株能在pH 7.0的环境下生长 试验菌株能在pH 9.0的环境下生长
试验结果
+ + - + + - + + + - ++ + - - ++ ++ +
加指示剂后在乙醚和培养基间有红色环
加入甲基红后培养基为红色 厌氧培养基中无菌体生长 菌体有生长，生长良好 菌体有生长，但生长受到抑制
菌体不生长 菌体不生长 菌体生长良好 菌体生长良好 菌体有生长
生理生化试验中，由一些操作和条件原因认为甲基红试验可能存在偏差。根据X-1菌株的菌落形态、菌体形态和生理生化特征，按照《伯杰氏细菌分类手册》[12]，初步将该菌株鉴定为芽孢杆菌科芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。 3结论与讨论
笔者从土壤中分离到一株产淀粉酶的芽孢杆菌，经过形态学和生理生化鉴定，初步鉴定为枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。运用碘液染色法筛选有产淀粉酶能力的菌株，但距离高产淀粉酶菌株的筛选还有一定的差距。如要筛选得到高产淀粉酶菌株，可采集多处土壤样品最为菌种来源，扩大选择范围，用碘液染色法初步筛选后，3,5-二硝基水杨酸显色法[13]进行复筛可提高筛选的准确性。对筛选出的菌株进行淀粉酶活力的测定，并进行培养基及发酵条件的优化提高淀粉酶的转化效率[14]。
近年来国内研究者对产淀粉芽孢杆菌进行了
较多的研究工作，在菌种的选育上采用了诱变育种技术[2]以及基因工程技术，如李由然[15]克隆了地衣芽孢杆菌的异淀粉酶基因，对其进行了定点突变，并实现在地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌表达宿主中表达，得到高淀粉酶活力的工程菌。范如意[16]等将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的中温α-淀粉酶基因BbA导入到地衣芽孢杆菌中表达，提高产α-淀粉酶地衣芽孢杆菌的发酵温度。芽孢杆菌产生的淀粉酶的性质研究也是目前一项重要的工作[17]。张应玫等[18]从筛选到的菌株ZX99鉴定得到一种新制淀粉酶(异麦芽低壤糖酶)，能催化淀粉的降解，产生异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖和异麦芽四糖等低聚糖。龙燕等[19]对芽孢杆菌WS-3L产生的淀粉酶的纯化和特性研究，表明对支链淀粉的水解效率最高，且对玉米淀粉有很强的吸附能力，从而可以作为玉米饲料的良好添加剂。随着农业和工业的发展，芽孢杆菌的选育及其所产淀粉酶的性质研究也体现出越来越重要的应用价值。
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