GST亲和层析介质使用说明书
一、 简介
GST亲和层析介质(GST Agarose)是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质,一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白,纯化条件温和,可以保证蛋白的活性。
本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶,具有优良的物理和化学稳定性,使用寿命长,操作方便,批次重复性好,易于放大,是研发与生产的理想选择。 二、 性能参数
特点 基质 吸附载量 介质平均粒径 最大流速 pH范围 使用温度 保存温度 保存液体 化学稳定性 基团密度高,载量大 6%的交联琼脂糖凝胶 ≥15mg GST融合蛋白(55kDa)/ml 100μm 300cm/h 3~10,在位清洗时pH范围可到2~11 常温 +4~8℃ 20%乙醇 室温下可在0.1M柠檬酸(pH 4.0),0.1 M NaOH,70%乙醇或6M盐酸胍中耐受2h,蛋白结合能力不受影响 三、 适用范围
分离谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。 四、 操作说明 1. 缓冲液配制
缓冲液A(平衡缓冲液):10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,140mM NaCl,2.7mM KCl,调节pH值至8.0。 缓冲液B(洗脱缓冲液):10mM Glutathione(还原型),50mM Tris-HCl,调节pH值至8.0。因Glutathione易氧 化,需现用现配。
(注:各种溶液配制完毕后,最好进行脱气处理,0.45 μm滤膜过滤备用)。 2. 样品预处理:
按每克湿重菌体/2~5ml平衡缓冲液的比例充分悬浮离心收集的菌体;600w功率,每循环超声3s,冷却3s,循环99×3次,破碎菌体;4℃、15000rpm离心15m,收集上清液,或用0.45μm滤膜过滤。 3. 装柱: 聚苯乙烯层析柱
1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上,封闭层析柱下端出口,向柱内充入纯水,排开层析柱内空气,先将垫片完全浸没于水面下方,在保持水平的状态下,小心推向底部,避免垫片下方滞留气泡。
2) 打开层析柱下端出口,排出柱中纯水;在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口,用移液枪按需要量吸取介质,或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流,将介质加入到层析柱中;静置30min,让介质自然沉降。
3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面,使介质表面保持水平状态,注意避免垫片与介质接触面滞留气泡(如对实验结果要求不严,也可不放入上垫片,以提高流速)。
4) 在使用一段时间后,如果层析柱流速减慢,可先用小镊子沿边缘将垫片推翻,夹出垫片,倒出介质,清洗或更换新的垫片后,按2)、3)所述 玻璃层析柱
1) 将层析柱洗净后垂直固定到铁架台上;向柱中加入蒸馏水,排开柱子中的空气,在蒸馏水排尽以前,关闭柱子出口,在柱内保留5~8cm高度的蒸馏水。
2) 先将介质混匀,用移液枪按需要量吸取介质,或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流,将介质加入到层析柱中;静置30min,让介质自然沉降。
3) 从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降平面,使介质表面保持水平状态,注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。
4) 在使用一段时间后,如果流速减慢,可先卸下上转换杆,将介质倒出,再取出下转换接头中滤网,清洗或更换后重新装柱。 4. 过柱:
1) 用10倍介质体积缓冲液A过柱,平衡介质;
2) 上样;
3) 用5~10倍介质体积缓冲液A过柱,洗去层析柱中剩余上样液并重新平衡介质; 4) 用5~10倍介质体积缓冲液B洗脱,收集洗脱液; 5) 用5~10倍介质体积缓冲液A重新平衡介质。
注:纯化过程流速不宜过快,对于1m