膜蛋白转运机制及相关蛋白质功能研究
摘要细胞分泌是基本的生命活动，是生物信息传递的关键环节。免疫防卫反应、细胞的生长、受精过程、细胞内外的物质交换、细胞膜上受体蛋白的嵌入以及再循环等细胞生理功能的实现都与细胞分泌活动有关，且所涉及的一些膜转运蛋白和分子机制是类似的。文章对分泌过程、相关蛋白质的功能以及对分泌的调控等进行了概述，介绍了国内外对膜蛋白转运机制及其相关蛋白质功能的最新研究成果，并对目前提出的假设及存在的问题进行了讨论与展望。 关键词细胞分泌囊泡转运胞吞膜蛋白
囊泡转运和分泌过程是生命活动的基本事件之一，是神经信号传导和内分泌激素释放的基础。分泌过程是一个连续的动态循环，包括囊泡在细胞内的生成、募集、拴系、锚定和激活，以及与细胞膜融合形成融合孔并将内容物释放到胞外等步骤，其后伴随着囊泡的胞吞和循环再利用。目前国际上形成了一个研究胞内蛋白质与膜转运、囊泡与细胞质膜的融合及细胞的分泌和胞吞过程中分子机制与调节途径的热点，这对于揭示神经信号传递、学习与记忆、内分泌激素分泌、细胞的生长、免疫细胞脱颗粒、膜上功能蛋白的嵌入等重要生命过程有着极其重要的意义。 1囊泡循环概述 分泌活动中，囊泡源自于从内质网到高尔基体的连续运输过程，并且要经过一个复杂的动态循环，尽管分泌过程各步骤之间难以截然分开，但各步骤中参与反应的分子有所不同，所受到的调控也不同，因而可将整个过程分为不同的功能阶段。 1．1囊泡的形成
在细胞中有多种途径形成囊泡，分泌囊泡可以由内质网或者高尔基体出芽产生，也可以通生，内涵体（endo-some）也可以分选出新的囊泡。分泌蛋白在内质网中合成以后，内质网会形成含有这些蛋白的转运囊泡，并移动到顺式高尔基体（cisgolgireticulum，CGN）的膜层，到达高尔基的顺面（cisface）。这些蛋白移动穿过高尔基复合体到达反面（transface），进 入反式高尔基体（tansgolgireticulum，TGN），在这里，蛋白质被分选到两类不同的囊泡中。一类囊泡直接与细胞膜融合并将其内容物（如胶原或血浆蛋白等分泌蛋白）释放到细胞外；而大多数分泌蛋白的分泌是不连续的，这些蛋白在TGN中被分选到另一类囊泡里，这类囊泡只有等受到刺激时才在细胞内转运并分泌，例如分泌激素的细胞是由不同的神经递质和激素刺激引起的。 1．2囊泡的募集
囊泡募集是胞浆内囊泡向细胞周边部位定向转运的过程。其分子机制涉及包括动力蛋白、Rab蛋白和SNARE蛋白等在内的多种囊泡蛋白与细胞骨架的相互作用以及多种调节因子的调控。从高尔基体到细胞周边部位的囊泡转运依赖于微管系统， ATP提供了囊泡运输所需要的能量。 1．3囊泡的拴系和锚定
拴系是指囊泡松散地附着于靶膜的过程或状态。拴系状态下，囊泡膜与靶膜的距离约为75～150nm。拴系后囊泡进一步靠近靶膜，两层膜之间的距离约为5～10nm，此过程或状态即囊泡的锚定。囊泡的拴系和锚定对保证囊泡与靶膜的特异性融合、以及细胞在正确的时间和空间内进行膜与蛋白质的转运具有重要意义，对维持各细胞器的特异性也十分关键。囊泡从拴系状态转变为锚定状态的分子机制目前还不清楚。一种可能是拴系复合物在与囊泡结合后发生大的构象改变，牵拉囊泡使之靠近靶膜；另一种可能是Sec1／Munc18蛋白与Rab蛋白效应物及拴系复合物或其它细胞膜蛋白相互作用，促进囊泡从拴系状态转变为锚定状态。 1．4囊泡的激活
锚定囊泡需要激活后才能与靶膜融合。囊泡的“激活”是囊泡获得与靶膜融合能力的过程。它是低浓度钙（数百纳摩尔）和磷脂酰肌醇代谢产物依赖性的耗能过程，需要ATP的水解提供自由能。囊泡激活的分子机制目前还不是十分清楚，大部分观点认为囊泡锚定后，Munc13与Munc18－1间的相互作用使得Munc18－1从Syntaxin上释放出来并使Syntaxin形成开放构象，解除Munc18－1对Syntaxin的抑制，启动SNARE复合体的形成，使囊泡进入激活阶段。
1．5囊泡的融合
囊泡膜与细胞膜融合及融合孔的形成是分泌过程的最后步骤，亲水性的囊泡内容物必须通过囊泡膜融合所形成的融合孔才能释放到胞外。在生物界至少存在三种膜融合形式：①病原微生物与属主细胞的胞外和胞内融合；②真核细胞的胞外融合，其分子机制目前不甚清楚，如精子与卵细胞的融合以及发育过程中肌细胞合胞体的形成；③细胞器的胞内融合，此过程研究得最多，如细胞内蛋白质与膜转运及囊泡胞吐过程中的膜融合。 2调节胞吞的基本途径
囊泡循环中内吞是个必要步骤，它既能保障细胞对基本营养物质的摄取和细胞膜蛋白转运机制及其相关蛋白质功能的研究囊泡转运和分泌过程是生命活动的基本事件之一，是神经信号传导和内分泌激素释放的基础。分泌过程是一个连续的动态循环，包括囊泡在细胞内的生成、募集、拴系、锚定和激活，以及与细胞膜融合形成融合孔并将内容物释放到胞外等步骤，其后伴随着囊泡的胞吞和循环再利用。目前国际上形成了一个研究胞内蛋白质与膜转运、囊泡与细胞质膜的融合及细胞的分泌和胞吞过程中分子机制与调节途径的热点，这对于揭示神经信号传递、学习与记忆、内分泌激素分泌、细胞的生长、免疫细胞脱颗粒、膜上功能蛋白的嵌入等重要生命过程有着极其重要的意义。
内离子浓度的调节，又能使细胞维持相对稳定的内环境。在反复的神经发放刺激下，囊泡内吞和再循环的速率决定了神经末梢保持神经递质释放的能力。如果内吞非常快，就会把已融合但还没有来得及释放的神经递质又重新内吞进胞内，这就有可能限制神经递质从囊泡中释放。由于分泌是量子释放的，从而还会限制分泌量子释放的大小。研究发现可能存在三种内吞途径。其中两条快速途径：①kiss－and－stay，囊泡释放后停留在活性带附近重新酸化和充填内容物并且仍锚定在活性带，停留在准备释放库（thereadilyreleasablepool，RRP）；② kiss－and－run，囊泡释放后在分泌位点局部区域去锚定，再循环利用但并不依赖于网格蛋白的调节。第三条是慢速途径：③囊泡依赖于笼形蛋白有被小窝内吞的途径，直接或间接通过内涵体为中介重新酸化并充填内容物。快速途径经常发生在低频刺激下，囊泡能够快速循环并进入RRP；慢速网格蛋白依赖的途径却经常发生在高频刺激下。
3分泌相关蛋白囊泡转运和细胞分泌过程有一系列蛋白质与蛋白质的相互作用参与调控。这些调控蛋白在酵母、线虫、大鼠、小鼠以及人类等生物体内具有高度的同源性，因此有人推断在生物体内膜融合和细胞分泌过程可能具有相同的机理。这些调控蛋白包括 N－乙基马莱酰胺敏感因子（NSF／Sec18）、可溶性NSF附着蛋白（Sec17／SNAP）、 SNAP受体（SNARE）、Sec1／Munc18（SM）蛋白以及Rab蛋白家族等。另外，Synapto- tagmin、Munc13和complexin等也是调控钙触发分泌的主要蛋白。 3．1SNARE蛋白复合体 SNARE（solubleN－ethylmaleimide－sensitiveattachmentproteinreceptor）蛋白是一类具有一个或两个SNARE特异序列的膜结合蛋白，根据其分布位置分为t－ SNARE和v－SNARE。t－SNARE位于靶膜上，包括Syntaxin和SNAP－25家族；v－ SNARE位于囊泡膜上，有Synaptobrevin／VAMPs（vesicleassociatedmembranepro-tein）及相关蛋白。SNARE复合体是Synaptobrevin、Syntaxin及SANP－25按1∶1∶1的比例形成的稳定三聚体，是由平行的4 个α螺旋束构成。核心的4个螺旋束在相互接触处都有一个由15个疏水残基构成的亮氨酸拉链层。在核心复合物的中心，有一个保守的离子层，它由1个精氨酸和3 个谷氨酰胺残基组成，这4个氨基酸残
基分别来自于4个α螺旋束，这个离子层通过四周的疏水层与水隔绝。 SNARE复合体在膜融合中起着十分关键的核心作用，是膜融合的融合器。Synaptobrevin或Syntaxin的突变或缺失都会明显地减少Ca2＋触发的分泌。切除 SNARE复合体单个位点的试验（用内切蛋白酶等）证明了完整的SNARE复合体很可能是分泌所必需的前提条件，没有它Ca2＋触发的分泌就不能发生。囊泡只有经历了锚定和激活阶段之后，才会具备被Ca2＋触发分泌的条件。囊泡锚定和启动的实质就是大量有功能的SNARE复合体的形成。 3．2Synaptotagmin钙离子传感器Synaptotagmin在Ca2＋触发的分泌中起着非常重要的作用，它是一种被广泛认同了的触发分泌的Ca2＋感受器，它的缺失会严重影响Ca2＋触发分泌的能力。Synaptotagmin是一个大的蛋白家族，是一种能与SNARE复合体、质膜等相互作用的囊泡膜整合蛋白。它由一个短的囊泡内的N末端序列、一个单个的跨膜区和一个大的细胞质部分组成。其中细胞质部分的主要特征是有2个Ca2＋连接的结构域（C2A和C2B区），含有4个钙离子结合位点，2个C2结构域通过几个氨基酸连接。在肾上腺嗜铬细胞中，通过突变使Synap- totagmin的功能丧失后发现，分泌的钙离子敏感性降低，分泌的延迟时间增长，分泌的速率下降。Synaptotagmin可能通过与Syntaxin的相互作用而调节融合孔动力学和细胞的分泌过程。所有这些表明，Synaptotagmin蛋白参与了钙离子触发的细胞分泌调控，在细胞分泌的关键步骤中起着至关重要的作用。 3．3Rab蛋白Rab蛋白属于小G蛋白家族，具有 GTP酶活性，能结合或水解GTP，可促进和调节细胞内运输囊泡的锚定与融合。当小 G蛋白结合了GTP时即成为活化形式（G－GTP），位于细胞膜、内膜和运输囊泡膜上，调节SNAREs复合体的形成，还可作用于其它下游分子使之活化，而当GTP水解成为GDP时（G－GDP），位于细胞质中，恢复到非活化状态。 3．4Munc13 哺乳动物具有四个Munc13基因（Munc13－1、Munc13－2、Munc13－3 和 Munc13－4）。Munc13促进囊泡激活的机制还不很清楚。可能的机制是Munc13与 RIM蛋白结合将Rab3置换出来，并使Syntaxin－Munc18复合体解聚，使Syntaxin游离出来稳定于开放构象，能与Synapto- brevin和SNAP－25结合，从而促进囊泡激活。 3．5SM蛋白 Sec1／Unc18／Munc18（SM蛋白）是由650～700氨基酸残基组成的亲水性蛋白质，游离态的SM蛋白存在于胞浆中。其种类较少，在线虫（C．elegans）和人类基因组中分别有5种和7种。线虫中第一个鉴定出的SM蛋白分子为Unc18，其哺乳动物的同系物称为Munc18，缺失这个基因的线虫其运动不协调，其后鉴定出的是参与酵母囊泡胞吐过程的Sec1。SM蛋白结构保守，分子形状呈弓状，有三个结构域，中间有V字形的裂口。 SM蛋白的功能之一是作用于囊泡锚定后的下游阶段，即调节SNARE复合体的聚合，以及囊泡的激活和膜融合反应。SM蛋白可能还参与Syntaxin的转运和循环过程。Munc18a的基因剔除、Tlg2p和Vps45p的缺失突变，均会引起syntaxin1的减少，反之在小鼠syntaxin4缺失突变的杂合子中，Munc18c蛋白水平减少了40％，所有这些表明SM蛋白和Syntaxin可能互为伴侣蛋白。 4结语细胞分泌是一个具有重要生理意义的基本生命活动。现在的一些相关研究成果主要是通过细胞生物物理方法（如膜电容记录、胞内测钙、钙离子光解释放、碳纤电极检测等）和分子生物学方法（如位点突变等）取得的。但由于分泌机制的复杂和实验技术上的限制，目前对触发分泌的认识还很不全面。如除少数已经确定的几种蛋白外，是否还有其他蛋白参与钙触发分泌的过程？各种蛋白是如何相互作用的？作用的具体部位和机制是什么？还有哪些物质可以调控这一过程？各种调控的具体途径是什么等。对触发分泌的机制与调控的深入研究，将会使人为的控制分泌成为可能，继而为一些与分泌有关的疾病的克服奠定基础。