用Hanahan方法制备感受态细胞——高效转化
DMSO DnD 溶液 转化缓冲液：
标准转化缓冲液：用于制备现用的感受态细胞
1M MES(pH6.3):将19.52过MES溶于80mL超纯水中，用KOH调节pH至6.3,用超纯水定容至100mL, 0.45um孔径的滤膜过滤除菌，分成小份-20℃保存; 试剂 1M MES(pH6.3) MnCl2 4H2O CaCl2 2H2O KCl 氯化六氨合高钴 H2O 需要量/L 10mL 8.91g 1.47g 7.46g 0.8g 定容至1L 终浓度 10mM 45mM 10mM 100mM 3mM 0.45um孔径的滤膜过滤除菌，分装后4℃保存。 冻存缓冲液（FSB）
1M KAc:将9.82g KAc90mL的超纯水中，用2M的醋酸将pH调至7.5，并用超纯水定容至100mL,分装成小份保存于-20℃; 试剂 1M KAc(pH7.5) MnCl2 4H2O CaCl2 2H2O KCl 氯化六氨合高钴 甘油 0.1N HCl H2O 需要量/L 10mL 8.91g 1.47g 7.46g 0.8g 100mL 定容至1L 终浓度 10mM 45mM 10mM 100mM 3mM 10%(V/V) 调pH至6.4 0.4um 滤膜过滤，分装并保存于4℃（在保存过程中，pH会降低至6.1-6.2，之后就稳定在这个水平） LB培养基
1． LB无抗培养基倒平板，划线培养大肠杆菌过夜;
2． 挑取单菌落，接种至3mL的LB培养基中，37℃、250～300rpm/min培养6-8h； 3． 将上述培养物接种至250mLLB培养基的1L三角瓶中，37℃振荡培养3h左右； 4． 将培养物转移至无菌、预冷的离心管内，冰浴10min； 5． 4℃2700g离心10min收集菌体；
6． 弃去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上吸干剩余液体；
7． 每50mL培养物加20mL预冷的TFB或FSB重悬菌体（轻轻旋转，不要用振荡器或吹吸混匀）,冰浴10min； 8． 4℃2700g离心10min收集菌体；
9． 弃去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上吸干剩余液体； 10．每50mL培养物加4mL预冷的TFB或FSB重悬菌体；
11．现用：每4mL悬浮液加入140uL DnD溶液于细胞悬浮液中央，迅速轻轻混匀，冰浴15min; 再加入140uL DnD溶液于细胞悬浮液中央，迅速轻轻混匀，冰浴15min;
分装成小份至冰上保存；
-70℃冻存：每4mL悬浮液加入140uL DMSO溶液于细胞悬浮液中央，迅速轻轻混匀，冰浴15min; 再加入140uL DnD溶液于细胞悬浮液中央，迅速轻轻混匀，冰浴;
迅速将悬液分装到冷却的无菌微量离心管中 ，封紧管口，没入液氮中快速冰冻感受态细胞，贮存于-70℃备用。
制备感受态大肠杆菌的Inoue方法
——制备超级感受态细胞
采用Inoue方法制备的大肠杆菌感受态细胞在效果很好时可以达到Hanahan法的转化效率，而在标准的实验室条件下，一般可达到1*10~3*10个转化子/ug质粒DNA。其优点在于不过分讲究细节，重复性更好，更有预见性。 缓冲液和溶液
DMSO(DMSO的氧化产物为二甲硫醚，是转化的抑制物，为避免这个问题，应使用高质量的DMAO) Inoue转化缓冲液（水的有机污染会降低转化效率，使用前预冷至0摄氏度）
0.5M的PIPES(pH6.7):15.1g PIPES溶于80mL水中，KOH调节pH至6.7后定容至100mL，0.45um孔径的滤膜过滤除菌，分成小份-20℃保存; Inoue转化缓冲液的配制： 试剂 MnCl2 4H2O CaCl2 2H2O KCl PIPES(0.5M,pH6.7) H2O 需要量/L 10.88g 2.20g 18.65g 20mL 定容至1L 终浓度 55mM 15mM 250mM 10mM 8
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0．45um孔径的滤膜过滤除菌，分装成小份-20℃保存 LB培养基
1． LB无抗培养基倒平板，划线培养大肠杆菌过夜;
2． 挑取单菌落，接种至3mL的LB培养基中，37℃、250～300rpm/min培养6-8h；
3． 将上述培养物接种至250mLLB培养基的1L三角瓶中，每瓶接种2~10mL，18℃中速摇床培养过夜； 4． 待其OD600达到0.55时，将培养物冰上预冷10min，同时离心机预冷至4℃； 5． 4℃2500g离心10min收集菌体；
6． 弃去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上吸干剩余液体；
7． 加80mL预冷的Inoue转化液重悬菌体（轻轻旋转，不要用振荡器或吹吸混匀） 8． 4℃2500g离心10min收集菌体；
9． 弃去上层培养液，将离心管倒扣在吸水纸上吸干剩余液体； 10． 20mL预冷的Inoue转化缓冲液轻轻重悬菌体； 11． 加入1.5mL DMSO，轻轻混匀，冰浴10min；
12． 迅速将悬液分装到冷却的无菌微量离心管中 ，封紧管口，没入液氮中快速冰冻感受态细胞，贮存于
-70℃备用。（液氮速冻可提高转化效率约5倍左右）
用氯化钙制备感受态大肠杆菌细胞
本方法可用于批量制备感受态细胞，转化效率可达5*10-2*10个转化子/ug超螺旋质粒DNA。此方法制备的感受态可以在-70℃冻存，但随着冻存期的延长，转化效率会有所降低。 CaCl2 2H2O(1M):使用时用水稀释10倍，并用0.45um孔径的滤膜过滤除菌，冰浴； 标准转化缓冲液（TFB）:用标准转化缓冲液可获得与CaCl2一致或更好的效果； CaCl2-MgCl2溶液，冰上预冷； LB培养基
1． LB无抗培养基倒平板，划线培养大肠杆菌过夜;
2． 挑取单菌落，接种至3mL的LB培养基中，37℃、250～300rpm/min培养6-8h；
3． 将上述培养物接种于200mLLB培养基的1L三角瓶中，37℃剧烈振荡培养3h左右至OD600=0.4； 4． 将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管内，冰浴10min； 5． 4℃4100rpm/min离心10min，回收细胞；
6． 弃去上层培养液，将离心管倒扣在吸水纸上吸干剩余液体；
7． 每50mL初始培养液用30mL预冷的0.1M的CaCl2-MgCl2(或TFB)重悬细胞沉淀；
8． 分装，直接做转化实验或冻存于-70℃。（细胞可在4℃在CaCl2中保存24-48h，在最初的12-24h内，
转化率增加4-6倍，之后降低至初始水平）
感受态制备：12mM HEPES(pH6.2-6.8)+66mM MnCl2+18mM CaCl2+317mM
收获前20-30min加入20mMMgCl2效率会提高
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