实验十一 凝胶层析法测定蛋白质分子量
实验目的：了解凝胶层析的原理及其操作，分离血红蛋白和胰蛋白酶（或蓝葡聚糖2000）。 实验原理：
凝胶层析也成凝胶过滤法，排阻层析、分子筛层析或渗透层析等是20世纪60年代发展起来的一种简便有效的生物化学分离分析方法。这种方法的基本原理是用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使物质分离。
用作凝胶的材料有多种，如交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。以交联葡聚糖分离物质和测定相对分子量为例说明凝胶层析法的基本原理和应用。
交联葡聚糖（Sephadex）是由细菌葡聚糖（以右旋葡萄糖为残基的多糖）用交联剂环氧氯丙烷交联形成的有三维空间的网状结构物。控制葡聚糖和交联剂的配比及反应条件就可决定其交联度的大小（交联度大，“网眼”就小），从而得到各种规格的交联葡聚糖，即不同型号的凝胶。“G”表示交联度，G越小，交联度越大，吸水量也就越小，见表3-3（P.41.）。G值越小，颗粒比较硬，G值越大，颗粒相比较软些（可以以手感触）。G值也对应凝胶的工作范围。
凝胶层析广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，洗脱时，此类物质沿着颗粒间隙下移，最先流出层析柱（板书：图3-14，3-15A）。而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，在凝胶颗粒的网孔内滞留的时间越长，结果是小分子的蛋白质洗脱速度较慢，即洗脱体积较大，最后流出柱外。不同一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。不同分子质量蛋白质的洗脱体积也不相同，通过部分收集器可以将它们收集在不同的洗脱组分中。Spladex G-10到G-50通常用于分离肽或脱盐。G-75到G-200可用于分离相对分子质量大于10000的蛋白质。
交联葡聚糖分子含有大量的羟基，极性很强，易吸水，所以使用前必须用水充分溶胀，并置于沸水浴中煮沸5小时（赶走颗粒中的空气），冷却至室温。
凝胶柱的总体积（总床体积）Vt是干胶体积Vg和凝胶颗粒内部的水的体积Vi（inner）及颗粒外部水的体Vo（outer）之和（图3-16）：Vt = Vg + Vi + Vo。
Vt可从柱的直径及高度计算；Vo（外水体积），常用洗脱一个已知完全被排阻的物质（如蓝葡聚糖2000）的方法来测定，此时其洗脱体积就等于Vo。
Vi为内部体积或内水体积，可从凝胶干重（mg）和得水值Wr计算（Vi=mg*Wr）；也可以从洗脱一个小于凝胶工作范围下限的小分子化合物，如铬酸钾来测定，其洗脱体积等于Vi + Vo。
某一物质的洗脱体积Ve为：Ve = Vo + KdVi
Kd为溶质在流动相和固定相之间的分配比例（分配系数），每一溶质都有特定的Kd值，与层析住的几何形状无关。如分子完全排阻，则Kd=0，Ve=0；分子完全进入，Kd=1，Ve=Vo+Vi。通常Kd是一个常数（0 凝胶层析测定蛋白质相对分子质量的过程是：先用层析柱洗脱一套已知相对分子质量的标准蛋白质，根据Ve/Vo~logMr（溶质相对分子质量的对数）成线性关系来算出样品相对分子质量（Mr）。 本实验使用的是葡聚糖凝胶SephadexG – 50为柱层析介质。 二、试剂 1、蛋白质混合液 （1）鸡血红蛋白（红色，分子量64500左右）和二硝基苯-胰蛋白酶（黄色，分子量24000）德混合物； （3）蒸馏水为溶济，分离蛋白，从颜色的不同，直接观察到血红蛋白洗脱较快，胰蛋白酶洗脱较慢。 (4) 蓝色葡聚糖2000： Mr=2×10 3mg（用50mmol/L磷酸缓冲液2mL溶解混合样品，备用。 2、洗脱液（水或50 mmol/L磷酸缓冲液，pH7.2） 3、SephadexG – 50 三、操作方法 1、 凝胶的溶胀 根据层析柱的体积和所选用的凝胶膨胀后的床体积，称取所需凝胶干粉，加适量洗脱液，置室温溶胀2～3天，可置沸水浴5小时（除去颗粒中的空气），反复倾泻去掉细颗粒。注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。装柱前最好将处理好的凝胶置真空干燥器中抽真空，以除尽凝胶中的空气。 2 6 2、装柱 将层析柱垂直固定，下端连接硅胶管并用弹簧夹夹注。向柱中加入约1/3高度的去离子水，由下端排出适量水，同时注意排出柱下端及硅胶管中的气泡，柱内余约3~5cm水时止住。 装柱前先将已溶涨的凝胶上面的溶液倒出一部分，然后轻轻搅起凝胶（用圆滑的玻璃棒，防止凝胶搅碎），将适当浓度的凝胶一次倒满凝胶柱，使之自然沉降（要注意颗粒间没有夹杂气泡，做好不用过稀的凝胶悬浮液装柱）。待凝胶沉积一段后（约3~5cm），由下端放出部分溶液（流速：5-6s一滴），在还没有形成凝胶床之前，由上端不断补充凝胶至柱高三分之二为止。夹住层析柱下端，使凝胶充分沉淀。注意凝胶床面要平整（装柱的标准：外观均匀，无气泡，无断层），如不平整，可用玻璃棒将局部搅起，重新沉淀。为防止加样时凝胶被冲起，可在凝胶表面上放一片滤纸。要注意在任何时候不要使液面低于凝胶表面，否则有可能混入气泡，影响液体在柱内的流动，从而影响分离效果。注意装柱过程中凝胶不能分层。 3、柱平衡 将洗脱液装入一个下口瓶，与层析柱连接，用少量蒸馏水洗柱，柱床稳定后吸除上层蒸馏水，关闭下端洗脱液出口， （四）样品的分离 吸去柱上端的洗脱液（切不要搅乱胶面，可复盖一张滤纸或尼龙网）。打开出水口，使残余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用细滴管吸取０.1 ml（2mg/ml）蛋白混合物或蓝色葡聚糖—2000，于柱中央慢慢加入柱中（加样不能沿壁加入），打开出水口（开始收集！），等溶液渗入胶床后，关闭出水口，用少许水（1-2ml）或洗脱液加入柱中（蒸馏水不能太多，防止样品稀释太大），渗入胶床后，柱上端再用蒸馏水（3-4ml）（或洗脱液）充满后用较慢的速度开始洗脱，直到两条色带分开为止，可以看到红色的鸡血红蛋白与黄色的胰蛋白酶明显分层（较窄的两条带）。 最后用蒸馏水将凝胶完全清洗，然后回收凝胶。 注：血红蛋白与二硝基苯-胰蛋白酶溶液最好临用前配制，否则可能区带不清。 3