分子生物学实验教材：
参考书：《分子克隆实验指南》 （第三版） 黄培堂 等译 科学出版社
实验一﹑大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
一.[目的要求]
通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。
二.[实验原理]
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。细菌处于0?C ，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA附着于细胞表面，经42?C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新表型如Amp得到表达，然后将此细菌培养物涂在选择性培养基上进行培养，从而获得转化子。
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三.[教学内容]
1.感受态细胞的制备基础知识及方法简介
2.CaCl2法制备 DH5?或JM109感受态细胞，计算转化效率 3.pUC19等质粒和重组产物转化大肠杆菌DH5?感受态细胞
四.[实验材料和用品]
E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA，eppendorf管。超净工作台、恒温摇床、生化培养箱、平皿、LB培养基、CaCl2 溶液、氨苄青霉素、等
五.[实验步骤]
一、 受体菌的培养
从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。 二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。 2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。 三、 转化
1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。 2、 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置
30分钟后。
3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 同时做两个对照:
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
六.[结果与分析]
１．计算转化率。
２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。
七.[问题与讨论]：
１．根据本实验认为影响转化率的因素有哪些？ ２．抗性法筛选原理是什么？
实验二﹑ 质粒DNA的提取和酶切
一.[目的要求]
1、通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法和技术 2、学习和掌握酶切的相关知识和操作
二.[实验原理]
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三.[教学内容]
1.质粒载体基础知识、多种质粒提取方法的介绍 2.碱裂解法提取载体质粒、含目的片段质粒
3.根据需要EcoRI、BamHI、XhoI酶切所提取的质粒,包括部分酶切和完全酶切
四.[实验材料和用品]
恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、Enpendorf管、含pUC19、pGEX质粒及含目的基因质粒的大肠杆菌、碱裂解溶液，酚、氯仿、乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、EcoRI、BamHI、XhoI等限制性内切酶
五.[实验步骤]
见教材
六.[结果与分析]
质粒DNA OD260,OD280的值，由此计算质粒DNA得率和ＤＮＡ纯度。
七.[问题与讨论]
1.简述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用及加入后的现象. 2.简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因. 3.简述影响酶切的因素.
实验三﹑琼脂糖凝胶电泳检测DNA
一﹑[目的要求]
通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术
二﹑[实验原理]
DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。
三﹑[教学内容]
1.电泳基本知识介绍 2.琼脂糖凝胶的制备
3.电泳检测质粒DNA及其部分酶切和不完全酶切的产物 4.质粒及其酶切产物的定量
四﹑[实验材料和用品]
恒温培养箱、台式离心机、高压灭菌锅、水平电泳系统、紫外透射仪、TAE电泳缓冲液、EB、加样缓冲液、琼脂糖等
五.[实验步骤]
见教材
六.[结果与分析]
在紫外灯(360nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶,并估计DNA样品量.
七.[问题与讨论]
影响凝胶电泳结果的因素有哪些?