实验22过氧化物酶活性的测定 过氧化物牌是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握常用的测定过氧化物酶的方法一愈创木酚法。 一、原理 在过氧化物酶(peroxidase)催化下,H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470m处有最大光吸收，故可通过测470 nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料 马铃薯块茎。 (二)仪器设备 722型分光光度计，离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。 (三)试剂 (1)0.05 mol/L.pH5.的磷酸缓冲液。 (2)0.05 mo/L愈创木份溶液。 (3) 2%H202。 (4)20%三氯乙酸。 三、实验步骤 (一)酶液的制备 取5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转人离心管中,于3000g离心10 min,上清被转人25 mL,容量瓶中。沉淀用5 mL磷酸缓冲液再提取两次，上清液并人容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。 (二)过氧化物酶活性测定 酶活性测定的反应体系包括:2.9 mL.0.05 mol/L磷酸缓冲液; 1.0ml.2%H2O2 ； 1.0mL.0.05mol/L愈创木面和0.1mL酶液。用加热煮沸5min的酶成为对照，反应体系加人酶液后，立即于37C水浴中保温15min.然后迅速转人冰浴中，并加人2.0ml.20%三氯乙酸终止反应，然后，过虑(或5000xg离心10min),适当稀释.470mm波长下测定吸光度。 四、结果计算 以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)。 过氧化物酶活性=???470×??????×????×0.01×??[u/（g.min）] 式中:?A470为反应时间内吸光度的变化 :W为马铃薯鲜重.g；t为反应时间，mins；VT为提取酶液总体积，ml；Vs为测定时取用酶液体积，mL。 实验24超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 （氮蓝四唑光化还原法） 一、原理 超氧物歧化酶(Superxide dismtae, SOD)普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离?子自由基(O?2的酶,它催化下列反应:2O2+2H+ H2O2+02反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。 本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生??O?2, O2可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560m处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料 水稻或小麦叶片。 (二)仪器设备 分光光度计，高速台式离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管，荧光灯。 (三)试剂的配制 （1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮） （2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。 （3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。 （4）20μM核黄素溶液：取0.00753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。 （5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存。 三、实验步骤 酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5--2ml于1000r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液。提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。 显色反应 取试管（要求透明度好）4，2为样品测定管，2为对照管，按表39-1加入各溶液。 混匀后将1支对照管置于暗处其他管于4000lx日光反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。 表39-1 各溶液加入量 试 剂（酶） 0.05mol/L磷酸缓冲液 130mmol/L Met溶液 750μmol/L NBT溶液 100μmol/L EDTA-Na2液 20μmol/L核黄素 酶 液 蒸馏水 总体积 用量(ml) 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.05 0.25 3.0 终浓度（比色时） 13mmol 75μmol 10μmol 2.0μmol 2支对照以缓冲液代替酶液 SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其它各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性： SOD总活性=(Ack?AE)×V0.5×??×????×?????? 式中 SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg蛋白表示； Ack为照光管的消光度值；AE为样品管的消光度值；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样鲜重，g。 苯酚法测定可溶性糖 一、原理 植物体内的可溶性糖是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是:糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛(分子式见蒽酮法)能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10- 100 mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485m波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定吸光度。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，试剂便宜，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色可稳定160 min以上。 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料 新鲜的植物叶片。 (二)仪器设备 分光光度计，水浴锅，刻度试管，刻度吸管。 (三)试剂 (1) 90%苯酚溶液：取90g苯酚(AR),加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。 (2) 9%苯酚溶液。取3 ml 90%苯酚溶液，加蒸馏水至30 ml,现配现用。 (3)浓硫酸(比重1.84)。 (4) 1%蔗糖标准液。将分析纯蔗糖在80 C下烘至恒重，精确称取1.000g加少量水溶解,转人100 mL容量瓶中，加人0.5 m浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度线。 (5) 100 ug/蔗糖标准液。精确吸取1%蔗糖标准液1mL，加入100mL容量瓶中，加水至刻度。 三、实验步骤 1.标准曲线的制作 取20mL刻度试管11支，从0~10分别编号，按表2-32-3加人溶液和水。 表2-32-3 苯酚法测可溶性糖绘制标准曲线的试剂量 管号 试剂 0 100ug.L-1蔗糖液/mL 0 1、2 0.2 3、4 0.4 5、6 0.6 7、8 0.8 9、10 1.0 水/mL 蔗糖量/ug 2.0 0 1.8 20 1.6 40 1.4 60 1.2 80 1.0 100 然后按顺序向试管内加人1mL9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以5—20s加人5 mL浓硫酸,摇匀。比色液总体积为8mL,在室温下放置30min,比色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定吸光度，以糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线,求出标准曲线方程。 2.可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10-0.30g,共3份(或干材料)，分别放人3支刻度试管中，加入5-10mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min(提取2次)，提取液过滤入25mL容量瓶中，反复漂洗试管及残渣，定容至刻度。 3.测定 吸0.5ml 样品液于试管中(重复2次)，加蒸馏水1.5mL，步聚与制作标准曲线相同，按顺序分别加人苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定吸光度。由标准曲线查出糖的含量。 四、结果计算 按下式计算测试样品的糖含量 从标准曲线查的糖的含量可溶性糖含量= 测定用样品液的体积106×样品重量×提取液体积×稀释倍数×100% 实验53脯氨酸含量的测定 在逆境条件下(旱、盐碱、热、冷、冻)，植物体内脯氨酸(proline,Pro)的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸,因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此,亦可作为抗寒育种的生理指标。 一、原理 当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中。色素的深浅即