AFLP 技术的基本原理与实验方法
AFLP 技术的基本原理:
AFLP 技术是一项新的分子标记技术，其原理是：基因组DNA经过二种酶不同的限制性内切酶酶切后，产生粘性末端，再使用连接酶将人工合成的双链接头连接在酶切位点的粘性末端。接头一端具有与内切酶同样的识别粘性末端，互补连接后成为DNA模板进行预扩增。接头和与接头相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。引物由3部分组成: ①核心碱基序列，该碱基序列与人工接头互补；②特异性酶切序列；③引物3’端选择性碱基。选择性碱基延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增。另外，通过选择在末端分别添加了1～3个选择性核苷酸的不同引物，可以达到选择扩增的目的。这些选择性核苷酸使得引物选择性地识别具有特异配对序列的内切酶酶切片段。并与之结合，实现特异性扩增。
实验方法:
(1) DNA 酶切
AFLP技术成功的关键在于DNA的充分酶切,所以对模板质量要求较高,在DNA完全溶解后利用紫外分光光度仪测定DNA浓度，将DNA浓度用双蒸水调整到50ng/ul,应避免其他DNA污染和抑制物质的存在。
表1：E-M酶切体系 反应体系（E-M组合） DNA（50ng/ul） 1.50ul EcoRⅠ(10u/ ul) 0.25ul MseⅠ (10u/ ul) 0.15ul Tango Buffer (10×) ddH2O ddH2O 总体积
8.10ul 12.5ul 16.2 ul 25 ul 总体积 12.5ul 25 ul 9.35ul 18.7 ul 2.50ul 3.0 ul 0.5 ul 0.3 ul 5.0 ul 1/2倍 1倍 表2：P-M酶切体系 反应体系（P-M组合） DNA（50ng/ul） 1.50ul PstⅠ(10u/ ul) 0.25ul 3.0 ul 0.5 ul 0.3 ul 2.5 ul 1/2倍 1倍 MseⅠ (10u/ ul) 0.15ul Buffer R (10×) 1.25ul 表3：P-T酶切体系 反应体系（P-T组合） DNA（50ng/ul） 1.50ul TaqⅠ(10u/ ul) 0.15ul 3.0 ul 0.3 ul 1.0 ul 2.5 ul 1/2倍 1倍 表5：M-S酶切体系 反应体系（M-S组合） DNA（50ng/ul） 1.50ul SacⅠ(10u/ ul) 0.5ul 3.0 ul 1.0 ul 0.6 ul 2.5 ul 1/2倍 1倍 PstⅠ (10u/ ul) 0.5ul Buffer Taq (10×) ddH2O 总体积
表4：E-T酶切体系 反应体系（E-T组合） DNA（50ng/ul） 1.50ul TaqⅠ(10u/ ul) 0.3ul 1/2倍 9.10ul 12.5ul 1.25ul MseⅠ (10u/ ul) 0.3ul Tango Buffer (101.25ul ×) 18.2 ul 25 ul ddH2O 总体积
表6：T-S酶切体系
8.95ul 12.5ul 19.9 ul 25 ul 1倍 反应体系（T-S组合） 1/2倍 1倍 3.0 ul 0.6 ul 0.5 ul 2.5 ul DNA（50ng/ul） 1.50ul SacⅠ(10u/ ul) TaqⅠ(10u/ ul) Buffer SacⅠ(10×) 0.25ul 0.3ul 1.25ul 3.0 ul 0.5 ul 0.6 ul 2.5 ul EcoRⅠ(10u/ ul) 0.25ul Buffer Taq (10×) ddH2O 总体积
9.20ul 12.5ul 1.25ul 18.4 ul 25 ul ddH2O 总体积 9.2ul 12.5ul 18.4 ul 25 ul 表7：常用内切酶酶切位点、最适温度、接头名称和预扩引物 内切酶 酶切位点 最适反应温度 接头名称 预扩引物 EcoRⅠ MseⅠ PstⅠ TaqⅠ G↓AATTC CTTAA↓G T↓TA A AAT↓T CTGCA↓G G↓ACGTC T↓CGA AGC↓T 37℃ 65℃ 37℃ 65℃ Ead Mad Pad Tad EA EC MC MG P0 TC TG 选扩引物 EA01－EA16 EC01－EC16 MC01-MC16 MG01-MG16 P001- P016 TC01-TC16 TG01-TG16 SacⅠ GAGCT↓C C↓TCGAG 37℃ Sad SA SA01-SA16 ※先将模板吸入PCR板中，再将内切酶、Buffer、双蒸水配制为Mix（因内切酶用量很少或者因少数枪头质量问题，每次吸取内切酶时一定要注意观察吸取是否足量），将配制好的Mix加入到模板中，最后在配好的反应体系中加入矿物油覆盖离心，放入PCR仪或水浴锅中37℃条件下5－6小时，然后立即转入65℃条件下1小时完全酶切。一般做1/2倍体系即可。目前本实验室拥有的内切酶有：EcoRⅠ；MseⅠ；PstⅠ；TaqⅠ；SacⅠ,以上内切酶均为Fermentas公司生产。
(2) 连接
表8：连接体系 连接体系 1/2倍 1倍 1.0 ul 1.0 ul 0.3 ul 5 ul 17.7 ul 25 ul Ead/Pad/Sad 0.5 ul 接头 Mad/Tad 0.5 ul T4连接酶（10u/ ul) T4连接酶Buffer ddH2O 总体积 0.15 ul 2.5 ul 8.8 ul 12.5 ul ※在连接的过程中不同的内切酶都有其对应的接头（表7），不同的酶切组合就用相应的接头组合。将配制好的连接Mix加入酶切产物中（要与酶切体系等体积），用保鲜膜包好室温下连接过夜。在配制连接Mix时T4连接酶Buffer容易产生沉淀，最好待其完全融解后适当振荡将沉淀溶解。
接头的制备：在公司合成的接头为单链干粉（2 oD/管，要将接头制备为双链。Mad的制备程
序是，先将MF和MR干粉在12000/分钟离心一分钟，然后MF加入127ul，MR加入135ul双蒸水完全溶解后各取127ul混合，在65℃水浴锅中10min再转入37℃/10min最后室温下放置10min即可。Ead、 Pad、Sad和Tad的制备程序是，先将EF(PF、SF、TF)和ER(PR、SR、TR)干粉在12000/分钟离心一分钟，然后EF(PF、SF、TF)加入1270ul，ER(PR、SR、TR)加入1350ul双蒸水完全溶解后各取350ul混合，在水65℃浴锅中10min再转入37℃/10min最后室温下放置10min即可。
（3）预扩增：
将连接产物稀释5倍混匀后作为预扩增的模板，在预扩的过程中每一种内切酶都有其对应的一组或两组预扩引物（表7），不同的酶切组合就用对应的一组或多组预扩引物组合。
表9：预扩体系（以E-M组合为例） 预扩体系 1倍 2倍