编 号 3 品保部实验操作指导书 制 定 主题 审 核 分析室样品检测指导书 编号 版 本 页 码 批 准 DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染 1． 目的：规范银染检测非变性聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质或DNA的测定方法与操作，特制定本规程。 2．范围：本规程适用于已知蛋白表达的测定。 3．责任：实验室检验人员对实施本规程负责。 4．实验原理： 在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。 5．仪器与器具 移液枪和枪头、脱色摇床、EP管、 205ml锥形瓶、塑料盒、电泳仪、垂直电泳槽及其附件、玻璃板 6．电泳试剂 6.1．30%丙烯酰胺溶液： 丙烯酰胺：29g,N,N’-亚甲基双丙烯酰胺：1g,加去离子水定容至100ml，装于棕色瓶内，4℃可保存两个月。 6.2．过硫酸铵0.1g/ml：称取过硫酸铵1g加去离子水值10ml。4℃可保存一周，-20℃可保存一个月。 6.3．TEMED(四甲基乙烯基二胺)：和 过硫酸铵一起作为交联反应的催化剂。易吸潮，4℃封闭保存。 6.4. 5*TBE电泳缓冲液 分别称取54克Tris,27.5克硼酸，20ml0.5M/EDTA(pH=8.0)定容至1L 6.5.上样Loading Buffer 分别准确称量溴酚蓝和二甲苯青各0.1克，转入50ml容量瓶中（黏附在称量纸上的少量粉末可用移液器西区甲酰胺钟乳容量瓶中），再介入1mlEDTA，最后用甲酰胺定容至50ml。 7.银染试剂 7.1固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1L。 7.2 0.4%硝酸银：硝酸银1克，水250ml。 7.3 1.5%氢氧化钠：氢氧化钠15克，水1L。 7.4 37%甲醛 8.非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备 8.1安装玻璃板夹心 8.1.1分别取内板（10cm*7.3cm）、外板（10cm*8.3cm）各一块（注意勿用手接触灌胶面的玻璃），将内板置于外板夹条一侧，使内外玻板底部、两边齐平（否则需重新安装），置于玻璃夹中，将两边固定（夹子应夹在侧边条中央位置）。 8.1.2红色硅胶条应保持清洁，以保证良好的密封性。然后将玻璃板置于制胶夹上的红色硅胶条中心，轻推夹牢即可，无需下压（按压夹子时应轻柔）。 8.2 制胶（6%） 8.2.130%聚丙烯酰胺（29:1）8ml,5*TBE，定容至40ml(每块胶约5ml),加过硫酸铵200ul，TEMED20ul, 插入梳子。室温凝固，垂直向上轻轻拔出梳子。避免产生气泡。（若有气泡，用手轻轻弹几下玻璃板，赶尽气泡） 8.2.2如制备好的凝胶长时间不用，需在梳孔中加入缓冲液，用保鲜膜包好，4℃保存。 9.样品处理 9.1根据样品性质选择加入Loading Buffer 1:2，混匀（送检样品时，需专人专板并按要求填写上样单、摆放好样品）； 9.2 若是DNA则放入PCR仪中95℃10min。时间到后立即放在碎冰上，冷却30min。若是蛋白质则放入电饭锅中沸水煮5min。上样（参照利用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白）。150V电压下电泳。 10.银染 10.1.固定液固定10min。 10.2.水洗2min*3次 10.3.0.4%硝酸银100ml+37%甲醛100ul，混匀，避光染色30min。 10.4 水洗3s*2次，动作要迅速。 10.5 1.5%氢氧化钠100ml，加37%甲醛1ml，混匀，显色至有条带出现。 10.6 水洗若干次，终止显色。 注意事项： 1．固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。 2．甲醛在使用前加入。 3．最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。 4．显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。 5．银染液和显色液需要预冷。 6．所用器皿要很洁净，不用手直接接触，以免杂蛋白污染！ 7．清洗用水尽量用高纯度去离子水，蒸馏水更佳，可以减少背景着色